关键词： 维甲酸；砷剂；柔红霉素；白血病，早幼粒细胞，急性；组织因子

摘要目的探讨全反式维甲酸（ATRA）、三氧化二砷（As₂O₃）及柔红霉素（DNR）对急性早幼粒细胞白血病（APL）细胞株NB4细胞组织因子（TF）表达的影响。方法用复钙时间检测NB4细胞的促凝活性（PCA）；用ELISA方法检测其TF抗原；用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测TF mRNA的转录水平。结果ATRA和As₂O₃均呈时间依赖的方式下调NB4细胞的PCA、TF抗原水平以及TF mRNA的转录；而DNR处理NB4细胞的PCA及TF抗原在早期上调，至24～48小时达到最大值。对PCR产物测序，发现APL细胞TF第5个外显子缺失的转录本。结论ATRA和As₂O₃均可下调APL细胞TF的表达并降低其PCA，改善APL患者的弥散性血管内凝血(DIC)出血症状；As₂O₃ 和DNR对APL凝血障碍不同效应的作用机制至少部分与药物对APL细胞TF表达和PCA的不同调节作用有关。

Effects of all-trans retinoic acid, arsenic trioxide and daunorubicin on tissue factor expression in NB4 cells

GUO Weimin,ZHU Jiang,WANG Hongli,et al.

Shanghai Institute of Hematology,Ruijin Hospital,Shanghai Second Medical University,Shanghai200025

AbstractObjectiveTo investigate the effects of all-trans retinoic acid(ATRA),arsenic trioxide(As₂O₃) and daunorubicin(DNR) on tissue factor(TF) expression in acute promyelocytic leukemia (APL) cell line NB4 cells. MethodsProcoagulant activity(PCA) of NB4 cells treated with 1μmol/L ATRA, 1μmol/L As₂O₃ or 0.2μg/ml DNR was detected using one-stage clotting assay, TF antigen by ELISA,and TF mRNA by RT-PCR. ResultsBoth ATRA and As₂O₃ could down-regulate the TF antigen, its mRNA transcription and membrane PCA of NB4 cells with a time-dependent manner, while DNR was shown to increase these parameters. Moreover, by dideoxy sequencing of DNA fragment derived from PCR, it was found that there was a exon 5 deletion transcript of TF in APL cells.Its biological significance remained unknown.ConclusionTF expression and PCA of APL cells may be down-regulated by ATRA and As₂O₃,therefore, As₂O₃ might also improve DIC-related hemorrhage of APL while inducing APL cells to apoptosis. The distinct regulation of TF and PCA on APL cells by As₂O₃ and DNR may at least partially contribute to their effects on APL coagulopathy through the influence on coagulant factors activation.

Key wordsRetinoic acidArsenic trioxideDaunorubicinLeukemia,promyelocytic,acuteTissue factor

急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia, APL）是一种具有严重出血倾向的急性白血病，使用全反式维甲酸（ATRA）或三氧化二砷（As₂O₃ ）治疗APL不但有效，而且可改善其出血症状。体内研究发现ATRA和As₂O₃可能通过抑制骨髓单个核细胞（其中80%以上为APL细胞）组织因子（tissue factor, TF）的表达、降低其促凝活性（procoagulant activity, PCA）而发挥作用^［1，2］。为探讨ATRA和As₂O₃ 改善APL出血并发症及其对凝血障碍影响的作用机制，我们检测了经ATRA、As₂O₃和柔红霉素（DNR）处理的APL细胞株NB4细胞的PCA、TF抗原和TF mRNA的水平及其对PCA和TF表达的影响。

材料和方法

1细胞培养

将NB4细胞置于含体积分数为10%胎牛血清的RPMI 1640培养液(Gibco-BRL)中，于37℃、体积分数为5% CO₂、饱和湿度的恒温培养箱中培养。收集分别经1μmol/L ATRA、1μmol/L As₂O₃和0.2μg/ml DNR处理0，6，12，24，48，72，96小时的NB4细胞，以未经药物处理的NB4细胞作为对照，用台盼蓝拒染法观察细胞活力。

2PCA检测

参照文献［3］方法，将收集的NB4细胞使用冰预冷的磷酸缓冲液(PBS，pH=7.4)洗1次，然后用PBS调节NB4细胞浓度为1×10⁷/ml，以50μl细胞悬液分别加等体积正常人混合血浆（NHP）、乏因子Ⅶ（FⅦD）血浆或乏因子Ⅷ（FⅧD）血浆（均为Diagnostic Stago产品），于37℃温育180秒，然后加50μl 0.05mol/L CaCl₂，在凝血分析仪（ST4 Diagnostic Stago）记录凝固时间，重复3次。

利用倍比稀释的TF标准品（Sigma）按上述方法测定复钙时间，以45秒凝固时间定为1TF活性单位，将稀释倍数和凝固时间进行双对数作图，计算TF活性。

3TF抗原(Ag)的测定参照文献［3］的方法。

4RNA抽提和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测TF mRNA的转录

应用TRIzol试剂(Gibco-BRL)一步法抽提APL细胞总RNA，用RNase-free DNase对抽提的总RNA进行消化，酚-氯仿抽提，紫外分光光度法定量，电泳鉴定；利用SuperScript Ⅱ（Gibco-BRL）将2μg RNA加随机引物进行逆转录；取1/8体积的逆转录产物进行PCR扩增。

TF上游引物5′-GGATGTGAAGCAGACGTACT-3′，位于TF第3外显子(5672～5691bp)，下游引5′-GTGTAGAGATATAGCCAGGA-3′，位于第6外显子（11211～11230bp），扩增的长度应为535bp。逆转录产物进行PCR扩增后得到了535bp和375bp两个条带，将PCR产物分别克隆到pGEM-T质粒后，用Sanger双脱氧法分别将重组质粒中的535bp和375bp两个插入片段进行DNA测序。

用限制性内切酶Hpa Ⅰ和EcoR Ⅰ进行双酶切，切除插入片段中的55bp，然后进行连接，以此作为内参照。PCR产物长度为480bp。

将构建的内参照模板经系列稀释后加入到上述逆转录产物进行PCR扩增，PCR扩增的条件为95℃1分钟，58℃1分钟，72℃1分钟，35个循环，取10μlPCR产物进行电泳鉴定。

结果

1ATRA、As₂O₃和DNR对NB4细胞PCA、TF抗原的影响

ATRA和As₂O₃均可降低NB4细胞PCA和TF抗原含量，其作用随温育时间延长而增强，而DNR处理NB4细胞的TF抗原及PCA在早期上调，至24～48小时达到最大值，随着DNR组NB4细胞活力迅速降低,其TF抗原及PCA急剧下降。同时还发现ATRA和As₂O₃下调NB4细胞TF抗原在时相上早于PCA；而且DNR上调NB4细胞TF抗原在时间上也早于PCA的上调(图1，2)。

图1ATRA、As₂O₃和DNR对NB4细胞PCA的影响

图2ATRA、As₂O₃和DNR对NB4细胞TF抗原的影响

2ATRA、As₂O₃和DNR对APL细胞TF mRNA转录的影响

ATRA和As₂O₃均可下调NB4细胞TF mRNA的转录，从图3可见，用RT-PCR扩增TF基因的内参照模板480bp条带在ATRA和As₂O₃组随时间延长而亮度逐渐增强，说明TF mRNA的转录随时间延长而逐渐减少，但ATRA的作用(6小时)较As₂O₃(24小时)出现早。

3APL细胞中存在第5个外显子缺失的TF转录本

利用Sanger双脱氧法将扩增的TF片段进行DNA测序，发现扩增的375bp的TF片段缺失了整个第5个外显子（9277～9436bp）160bp的TF转录本，TF mRNA的这种选择性剪切使TF第4外显子3′端8669nt与第6外显子5′端11157nt相连接。

每一时间点自右至左依次加入0.025，0.0125，0.00625pg TF内参照模板对逆转录产物进行PCR扩增，扩增的TF片段长度为535bp，内参照的长度为480bp，375bp为缺失第5个外显子的TF片段

3ATRA、As₂O₃对NB4细胞TF mRNA表达水平的影响

讨论

APL细胞表面TF的异常高表达是APL并发弥散性血管内凝血（DIC）出血的一个重要原因。ATRA和As₂O₃ 可有效地治疗APL，并改善出血症状^［1］。我们的研究发现经ATRA和As₂O₃处理NB4细胞TF抗原水平及其PCA随时间延长而逐渐下降<