关键词： 血小板；抗体，单克隆，CD9；血小板糖蛋白GPⅡb-Ⅲa复合物

摘要目的研究两种CD₉单克隆抗体(McAb)HI117和SJ9A4对人血小板膜纤维蛋白原受体功能的调控作用及其可能的作用机制。方法利用¹²⁵I标记人纤维蛋白原（Fg），观察HI117和SJ9A4作用下血小板Fg特异性结合量，反映血小板膜上Fg受体的暴露情况，并观察无Fg存在条件下，由HI117和SJ9A4诱导的Fg受体暴露后的变化。结果HI117和SJ9A4均能显著诱导血小板与Fg特异性结合，而在无Fg存在时，两种McAb诱导的Fg受体会很快“关闭”，失去结合Fg的能力；抑制蛋白激酶C(PKC)活性,应用Aspirin、Apyrase和(或)PGI₂预处理血小板，能不同程度地抑制HI117和SJ9A4诱导的血小板膜Fg受体暴露。结论HI117和SJ9A4均能诱发血小板膜Fg受体暴露，两者诱发人血小板Fg受体暴露可能是三条途径综合作用的结果：即二磷酸腺苷释放、血栓烷生成和环磷酸腺苷途径，而PKC激活可能是三条途径的共同通路。

Characteristics of human platelet fibrinogen receptors regulated by anti-CD₉ monoclonal antibodies

WU Huaizhu, LI Jiazeng, PENG Lin, et al.

Institute of Hematology,CAMS and PUMC, Tianjin300020

AbstractObjectiveTo investigate the regulatory effect of two anti-CD₉ monoclonal antibodies (McAbs), HI117 and SJ9A4, on human platelet fibrinogen receptors, and explore their potential mechanisms. MethodsBy using¹²⁵I-labeled human fibrinogen (Fg), the Fg specifically bound to human platelets induced by HI117 and SJ9A4 was measured,and the changes of anti-CD₉McAbs-exposed Fg receptor in the absence of Fg were also observed. ResultsHI117(10μg/ml)and SJ9A4 (20μg/ml) induced markedly the specific binding of Fg to human platelets, suggesting that the two McAbs evoked obvious exposure of Fg receptors .But in the absence of Fg, the McAbs-exposed Fg receptors gradually lost their capacity to bind Fg and closed. Further study indicated that HI117 and SJ9A4-induced Fg binding was reduced by pretreatment of platelets with sphingosine, aspirin, apyrase, and/or PGI₂. Conclusion The anti-CD₉ McAbs, HI117 and SJ9A4, can reversibly expose platelet Fg receptors, probably via three signaling pathways, i.e. thromboxane, secreted ADP and cAMP，protein kinase C (PKC) activation presumably being the common passage for the signaling.

Key wordsPlateletAntibody,monoclonal,CD₉Platelet glycoprotein GPⅡb-Ⅲa complex

CD₉/P24是一种存在于包括血小板在内的多种细胞的浆膜、相对分子质量为24×10³的糖蛋白,CD₉分子中有4个疏水区,往返4次穿过细胞膜,与其它多种同源性膜蛋白共同组成“4次跨膜蛋白”(Tetraspanin)超家族^［1］。迄今已发现有多种CD₉单克隆抗体(McAb)可诱导血小板活化。我们也曾对两种CD₉ McAb(HI117和SJ9A4)激活血小板的特性进行研究,揭示了此两种CD₉ McAb在激活血小板时，引发血小板骨架蛋白磷酸化、血小板胞浆钙离子浓度变化^［2,3］。鉴于血小板活化时的聚集功能有赖于血小板膜上纤维蛋白原受体的暴露及其与纤维蛋白原（Fg）的结合^［4,5］,我们对两种CD₉ McAb对血小板膜Fg受体功能的调控作用作了研究,旨在深入认识CD₉ McAb激活血小板的机制。

材料和方法

1实验材料

人Fg、阿斯匹林（Aspirin）、腺苷三磷双磷酸酶（Apyrase）、前列环素（PGI₂）、Sphingosine、二磷酸腺苷（ADP）均购自Sigma公司; HEPES为Merck公司产品; Na¹²⁵I购自美国杜邦公司。

2McAb制备和纯化

常规杂交瘤技术制备CD₉ McAb HI117(IgG₃)和SJ9A4(IgG₁);腹水经饱和硫酸铵沉淀粗提,再分别用蛋白A-Sepharose 4B和DEAE Affi-Gel Blue亲和层析法提纯。

3人Fg的放射标记

以氯胺T法用¹²⁵I标记人Fg,其放射性活度为207 kBq,放化纯度＞95%。

4人血小板悬液的制备

用ACD抗凝的健康成人新鲜静脉血,常规分离血小板,经Tyrode's缓冲液（含1μmol/L PGE₁）洗涤2次，然后再将血小板混悬于Tyrode's缓冲液(含0.5mmol/L CaCl₂，但不含PGE₁),调制成血小板数为200×10⁹/L的悬液。

5血小板膜Fg受体功能的测定

5.1Fg受体的暴露: 向血小板悬液中加入¹²⁵I-Fg,混匀,再分别加CD₉ McAb(HI117或SJ9A4)或ADP激活血小板(不搅拌),37℃条件下作用30分钟,离心沉淀血小板,用γ-计数仪分别测定上清液和血小板结合的放射活性,计算CD₉ McAb(或ADP)作用下Fg与血小板的特异性结合量(以未激活血小板与Fg的结合作为非特异性结合),反映血小板激活后Fg受体的暴露。

5.2Fg受体暴露后的“关闭”: 分别将CD₉ McAb或ADP加入血小板悬液(不含Fg),刺激血小板, 随后在0，5，10，15，20，25，30分钟分别取样, 立即加入 ¹²⁵I-Fg, 37℃条件下反应30分钟,然后按5.1所述方法测定血小板被刺激后不同时间其Fg的特异性结合量,反映无Fg存在时,活化血小板Fg受体暴露后的“关闭”。

6PKC、ADP释放、血栓烷A₂(TXA₂)、环磷酸腺苷(cAMP)在CD₉ McAb诱发血小板膜Fg受体暴露中的作用

分别向血小板悬液中加入Sphingosine (25μmol/L, PKC抑制物)、Aspirin(30μmol/L,TXA₂生成抑制物)、Apyrase(10U/ml,ADP清除物)和(或)PGI₂(1μmol/L,升高cAMP水平),37℃温育15分钟,然后加入¹²⁵I-Fg,混匀,再分别用HI117或SJ9A4刺激血小板,按5.1所述方法测定血小板上Fg特异性结合量。

结果

1CD₉ McAb诱发血小板膜Fg受体暴露

将¹²⁵I-Fg加入到血小板悬液,分别用10μg/ml、20μg/ml HI117或SJ9A4或8μmol/L ADP激活血小板后,发现血小板Fg结合量明显增加。图1显示激活后血小板Fg结合量与悬液中Fg浓度的关系，未受刺激血小板的Fg结合量为非特异性结合,小于最大结合量的5%;由此提示CD₉ McAb激活血小板后，显著诱发其膜表面Fg受体暴露。

图1HI117、SJ9A4、ADP诱导的血小板Fg特异性结合

2血小板膜Fg受体暴露后的“关闭”

在血小板悬液中无Fg存在情况下，分别用HI117、SJ9A4或ADP激活血小板，分别在激活后不同时间取样，加入¹²⁵I-Fg，测血小板Fg结合量。发现此条件下，血小板在激活后随时间延长其Fg结合量迅速下降（图2），在受到HI117、SJ9A4、ADP激活后30分钟，血小板的Fg结合量分别降至其激活后即刻结合量的22.0%、25.0%和22.5%。由此显示，在无Fg存在条件下，CD₉ McAb（及ADP）诱发的血小板膜Fg受体会逐渐“关闭”，失去结合Fg的能力。

注：所有结果均为两次实验的均数，以激活即刻时的血小板表面Fg结合量为100%

图2预先无Fg存在条件下，血小板被HI117、SJ9A4、ADP

激活后不同时间Fg结合量的变化

3PKC、ADP释放、TXA₂、cAMP在CD₉ McAb诱发血小板膜Fg受体暴露中的作用

分别用Sphingosine、Apyrase、Aspirin和(或)PGI₂预处理血小板，然后再分别以HI117和SJ9A4刺激血小板，测定处理后血小板的Fg结合量，结果见表1。

讨 论

HI117和SJ9A4是CD₉抗原的两种McAb，在以往研究中，我们发现HI117和SJ9A4在血小板膜CD₉抗原上的识别肽段不同，但两者均能诱导人血小板产生聚集等活化反应^［2,3］。血小板聚集是由活化血小板膜表面GPⅡb/Ⅲa暴露Fg受体并随之与Fg结合所介导^［4,5］。因此，我们的研究利用¹²⁵I-Fg为主要工具，探讨HI117和SJ9A4对血小板膜Fg受体功能的调控作用，研究发现HI117和SJ9A4均可诱发人血小板与Fg发生特异性结合，显示此二种CD₉ McAb<