文献报道HLA蛋白质一级序列上不同氨基酸数量的多少与HLA空间构象的改变并不呈正比^[1]，有时仅1个氨基酸的差别就可引起HLA分子三维结构的明显变化；骨髓移植(BMT)实践表明，有时1个或几个HLA等位基因不相合的骨髓移植后并未发生移植物抗宿主病(GVHD)^[2]。近年来，使用软件分析蛋白质特性及比较三维结构的差异已成为一种重要的科学实践手段。我们为探索HLA分子三维构象模拟分析与GVHD的关系而进行了相关研究。

病例和方法

1病例1例无血缘关系的骨髓移植供体来自台湾，男性；受体为我院拟进行骨髓移植的患者，女性。另2例为文献报道的HLA－DR4基因亚型不合的骨髓移植病例^[3]。

2DNA提取采用Promega公司DNA提取试剂盒提取人外周血DNA。具体操作按试剂盒说明书进行。

3HLA－Ⅰ、Ⅱ类分型HLA－A、B抗原分型采用Terasaki血清板，用经典的微量淋巴毒实验进行分型。HLADRB1、DQB1基因采用美国Lambda公司的微量SSP^TMHLA－Ⅱ类DNA分型试剂盒。反应管置于PE－9700循环仪上，取10μl扩增产物于25g/L的琼脂糖凝胶(含5g/L溴化乙锭)中电泳，140V，3min。紫外灯下观察结果。

4混合淋巴细胞培养按文献^[4]方法。

5HLA分子空间结构模拟分析首先通过http://ASHI/HLA SEQUENCE检索到HLA蛋白质的氨基酸序列，再将其通过电子邮件传送至Automated Protein Modeling Sever(http://expasy.hcuge.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html)进行模拟，模拟的参照分子主要为HLA－DRB10101，HLA－A0201及HLA－B2705等已有晶体衍射资料的HLA蛋白质，将计算机得出的原子坐标数据转换成三维图象进行比较。

结果和讨论

1高分辨HLA分型结果1例无血缘关系的骨髓移植供、受体，其HLA-Ⅰ类抗原型别完全相合，Ⅱ类基因型别除DR4外完全相合，供者为HLA-DRB10401，而受体为HLA-DRB10405。

2混合淋巴细胞培养结果对该例BMT供、受体进行的体外GVHD模拟实验表明，双向SI=7.50，单向SI=2.09，GVH的发病风险为16.60％，HVG发病风险为9.10％。

3三对蛋白质的氨基酸序列比较HLA－Ⅱ类分子与抗原及T细胞的主要作用部位在α1区，而编码该区域的寡核苷酸序列位于第2外显子，是HLA－Ⅱ类分子的高度多态性部分，其它部分在各亚型之间几无差别。HLA－DRB10401与0405之间仅在第57位差1个氨基酸，0401为D，而0405为S。文献报道的HLA－DR4型别不合的骨髓移植病例中，1例供体为HLA－DRB10401，受体为HLA－DRB10404，二者在蛋白质一级序列的第71(K→R)和86(G→V)位氨基酸上有2个氨基酸的差别，BMT后发生了Ⅱ级GVHD；另1例供体为0401，受体为0408，二者在蛋白质一级序列的第71(K→R)位上只有1个氨基酸的差别，BMT后发生了Ⅳ级GVHD。

4HLA蛋白质的结构模拟与比较进行计算机模拟比较的区域是出现变化的α1链。结果表明，模拟的蛋白质结构与文献报道的HLA晶体衍射资料十分接近，含有表明HLA分子特性的1条α螺旋和4条β片层结构（图1）。HLA－DRB10401/0405只差1个氨基酸，在空间结构上的差异较明显（图2）。HLADRB10401/0404差2个氨基酸，但反映在空间结构上的变化不太明显；而HLADRB10401与0408只有1个氨基酸不同，但反映在空间结构上的变化却十分明显。这3对蛋白质上的变化都出现在α螺旋及其附近区域(图3，4）。

HLA-Ⅱ抗原结合区的典型结构：一条α螺旋和4条β折叠。其中，红色代表α螺旋，

黄色代表β折叠，蓝色代表β转角，白色代表无轨卷曲

1HLA-A-DRB1*0401与0404的三维结构

HLA-DRB1*0401与0405之间蛋白质一级序列的第57位上相差1个氨基酸，0401为D，

而0405为S，但它们的酸碱性发生了改变，表现在空间结构的α螺旋上差别较明显，

这可能是MLC发生强瓜的结构基础

2HLA-DRB1*0401与0405的三维结构比较

HLA-DRB1*0401与0404之间在蛋白质一级序列的第71（K→R）和（G→V）

位上相差2个氨基酸，它们的极性发生了改变，表现在空间结构的α螺旋上的差别不是很明显,

这可能是BMT后发生Ⅱ度GVHD的结构基础

3HLA-DRB1*0401与0404的三维结构比较

HLA-DRB1*0401与0408之间在蛋白质一级序列的张71(K→R)位上相差1个氨基酸，

它们的侧链基团发生了改变，表现在空间结构的α螺旋上的差别很明显，

这可能是BMT后只发生Ⅳ级GVHD的结构基础

4HLA-DRB1*0401与0408的三维结构比较

本课题受全军医药卫生科研基金（96M064）资助

参考文献

1Takemoto S,Terasaki PI.Refinement of permissible HLA mismatches.In:Terasaki PI,Cecka JM,eds. Clinical Transplants.Los Angeles: UCLA Tissue Typing Laboratory, 1994.451－466.

2Liu MD,OuYang SG,Ma EP,et al.Modeling and comparing of HLA from donor and recipient in bone marrow allotransplantation. Chin J Organ Transplant, 1998, 19: 130－132.

3Yamanaka K,Kwok WW,Mickelson EM, et al. Selective T－cell－receptor gene usage in allorecognition and graft－versus－host disease. Transplant,1993,55: 1167－1175.

4杨廷彬，尹学念，主编.实用免疫学.长春：长春出版社，1994.606－607.

(收稿：1999－01－07修回：1999－04－30)

(校对：王叶青)