关键词： 柴胡受体，糖皮质激素RNA，信使细胞系，HL-60细胞凋亡

摘要目的观察柴胡皂甙d（SSd）对HL-60细胞糖皮质激素受体（GR）mRNA表达的调节作用以及对细胞凋亡的影响。方法选用从柴胡中提取的单体成分SSd，以³H-胸腺嘧啶掺入法观察SSd对细胞生长的抑制作用，DNA凝胶电泳及流式细胞术分析细胞凋亡，用Northernblot分析GRmRNA的改变。结果经SSd作用后，HL-60细胞3H-胸腺嘧啶掺入率明显降低，呈时间和剂量依赖关系，10μg/mlSSd处理48小时作用最明显，60小时时出现典型的DNA片段梯形带，流式细胞仪分析细胞阻滞于G1期并出现凋亡峰；GRmRNA表达增加。结论SSd可上调HL-60细胞GRmRNA表达并诱导细胞凋亡。

Saikosaponin-d up-regulates GR mRNA expression and induces apoptosis in HL-60 cells

BU Shizhong, XU Jinlian, SUN Jihu, et al.

Department of Physiology， Second Military Medical University, Shanghai 200433

Abstract Objective To research the effect of saikosaponin-d (SSd) on the expression of glucocorticoid receptor (GR) mRNA and induction of apoptosis in HL-60 cells. Methods Antiproliferation effects of SSd on HL-60 cells were determined by 3H-thymidine incorporation. Apoptosis of the SSd-treated cells was determined by DNA fragmentation analysis and flow cytometry. GR mRNA was analyzed by Northern blot analysis. Results After 48h treatment with 10 μ g/ml SSd,3H-thymidine incorporation was decreased in HL-60 cells and the effects were time and dose dependent. DNA ladder appeared after 60h treatment with SSd. The flow cytometry analysis showed HL-60 cells was arrested at G0/G1 phase and apoptotic peak appeared in sub-G1 phase. The expression of GR mRNA was increased. Conclusion SSd up-regulates the expression of GR mRNA, inhibits the cell growth and induces apoptosis in HL-60 cells.

Key words Bupleurum chinense Receptor,glucocorticoid mRNA Cell lines,HL-60 Apoptosis

柴胡为中药常用药，其有效成分柴胡皂甙有抗炎、调节内分泌和免疫系统的功能,对细胞生长也有调节作用[1],柴胡皂甙可分为a、b、c、d、e、f、g、h、i9种，具有上述作用的是柴胡皂甙d（SSd)[2]。SSd有糖皮质激素（GC）样甾环结构，在生物体的生长、发育和细胞凋亡过程中GC起着极其重要的作用，而这些作用都是通过糖皮质激素受体（GR）介导的。我们将以HL-60细胞为研究对象，观察SSd对HL-60细胞GRmRNA表达的影响和对细胞凋亡的调节作用。

材料和方法

1材料SSd为日本WakoJunyaku公司产品，溶解于无水乙醇。HL-60细胞引自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库，HL-60细胞浓度为1×106/ml，在37℃，体积分数为5％的CO2培养箱中培养。

2³H-胸腺嘧啶掺入分析^[3]将HL-60细胞置于96孔培养板，每孔加100μl细胞悬液，再加74kBq3H-胸腺嘧啶(特异活性为8.14×1012Bq/mol,中国科学院上海原子核研究所提供)，作SSd对3H-胸腺嘧啶掺入影响的剂量依赖性和时间依赖性分析。

3DNA片段的测定^[4]参照上述剂量依赖性和时间依赖性分析的结果，以SSd处理HL-60细胞后作DNA片段测定。取1×106个培养细胞，经PBS洗涤后加入细胞溶解液，4℃10分钟，高速离心，取上清液加入2μlRNaseA（2.5μg/μl）溶液37℃孵育1小时，再加入2μl蛋白酶K（2.5μg/μl）37℃孵育1小时，加入5mol/LNaCl和异丙醇－20℃过夜，离心去除异丙醇，加入TE缓冲液溶解DNA，以20g/L琼脂糖凝胶电泳。

4流式细胞仪测定凋亡细胞和细胞周期^[5]取经SSd处理及对照组细胞各1×106个，PBS洗涤，以体积分数为70％的冷乙醇4℃固定4小时，离心去除乙醇，加入40μl磷酸枸橼酸缓冲液（0.10mol/L磷酸二氢钠，0.25mol/L磷酸氢二钠，体积分数为0.15％的TritonX100，1g/L枸橼酸钠）悬浮细胞，室温30分钟，离心，PBS100μl悬浮沉淀细胞，加入RNaseA溶液1μl，37℃孵育30分钟，加入碘化丙锭溶液50μl（1mg/ml）混合，置暗室30分钟染色。流式细胞仪测定。

5总RNA抽提和Northern印迹法测定GRmRNA细胞总RNA抽提按照硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法[6]加以改进，经DABA法[7]测知其中DNA含量小于1％[吸光度(A)260/A280＞1.8]，通过电泳转移交联于尼龙膜上，与α32PdATP标记的人GRcDNA(编码DNA结合区)或β肌动蛋白(β-actin)cDNA(比活性为5×108min－1 ^. μg－1)于65℃杂交过夜。杂交信号于－70℃放射自显影。湿润的尼龙膜用10mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸(TrisHCl,pH8.0),1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),1g/L十二烷基磺酸钠(SDS)于95℃洗20分钟，可除去杂交信号，用于下一次杂交。

6统计学方法采用t检验。

结果

1SSd对HL-60细胞3H-胸腺嘧啶掺入率的影响经SSd处理后的HL-60细胞3H-胸腺嘧啶掺入率明显下降，处理时间为48小时时，3H-胸腺嘧啶掺入率随剂量增加而逐渐下降，10μg/ml时下降最明显（与剂量为7.5μg/ml时的掺入率相比，P〈0.01）。在10μg/ml剂量不变的条件下，随处理时间的延长3H-胸腺嘧啶掺入率逐渐下降，48小时时掺入率下降最明显（与处理36小时的掺入量相比，P〈0.01）。以上实验均重复3次。

2SSd诱导HL-60细胞凋亡的DNA片段分析如图1所示，HL-60细胞经10μg/mlSSd处理60小时，琼脂糖凝胶电泳显示有大量DNA片段形成，并呈典型的凋亡DNA梯形带。

1：无水乙醇对照；2～5：分别为10μg/mlSSd处理24,36,48,60h

图1HL-60细胞DNA凝胶电泳分析

3HL-60细胞的流式细胞仪分析如图2所示，HL-60细胞经10μg/mlSSd处理60小时后，细胞被阻滞在G1期，并出现明显的亚G1期凋亡峰。

图2HL-60细胞的流式细胞仪分析

4Northernblot分析SSd对HL-60细胞GRmRNA表达的影响SSd处理48小时后GRmRNA明显增加（图3）。

1：SSd处理；2：无水乙醇对照

图3Northernblot法检测HL-60细胞GRmRNA表达结果

讨论

SSd具有GC样的甾环结构，近期有报道，SSd可刺激下丘脑促肾上腺皮质激素释放因子和垂体促肾上腺皮质激素的分泌，也可刺激垂体前叶促肾上腺皮质激素前体物质前阿黑皮原的基因表达[8]；SSd有明显的增加巨噬细胞微丝和微管的功能，增强该细胞的吞噬活性；SSd能增加T淋巴细胞的活性，对白细胞介素2及其受体的表达有诱导作用。SSd的这些作用可能与其具有与GC相似的甾环结构有关，GC具有抗炎、调节免疫功能的作用，同时对细胞的生长和凋亡有重要的调节作用，GC的这些作用都是由GR介导的。本研究结果表明，SSd可有效地降低HL-60细胞3H-胸腺嘧啶掺入率，胸腺嘧啶是细胞增殖中胞核合成所必需的成分，所以SSd可明显抑制HL-60细胞增殖，其效应呈剂量依赖和时间依赖关系。流式细胞仪分析也支持这一结果，经SSd处理的HL-60细胞G0/G1期细胞增加，S期细胞减少，呈现明显的G0/G1阻滞现象，在前G1期出现明显的凋亡峰，表明SSd可明显抑制HL-60细胞S期DNA合成，干扰蛋白质代谢，从而抑制细胞的分裂增殖。细胞凋亡时最明显的特征是染色体DNA断裂成相对分子质量约为200bp的片段，凝胶电泳分析时呈典型的梯形排列。本研究显示，10μg/mlSSd处理HL-60细胞60小时后细胞出现凋亡特征性改变，提示SSd在阻止细胞生长的同时可诱导HL-60细胞凋亡。

Northern blot分析GRmRNA表达的结果表明，SSd抑制HL-60细胞增殖、诱导细胞凋亡时，GRmRNA表达明显增加。GC的生物学活性都是通过细胞的基因组调节机制，由GR介导的，GC的作用决定于GC和GR两方面因素，GC对GR及GRmRNA的表达有负向调节作用，因此增加GC的浓度，虽然GC的生物学效应增强了，但GRmRNA的表达则大大降低。在GC含量不变的情况下，增加GRmRNA的表达，可提高GC的生物学功能并避免增加GC剂量所引起的一系列不良反应。本研究中，在其它细胞培养条件不变的情况下，HL-60细胞经SSd处理后，GRmRNA表达增加，同时，SSd对细胞的生长有明显的抑制作用并可诱导细胞凋亡，这可能是因为SSd有GC样甾环结构，且在功能上部分与GC相同，不同的是GC下调GRmRNA表达，而SSd使GRmRNA表达增加。

参考文献：

1贾琦，张如意.柴胡属植物中皂甙化学研究进展.药学学报，1989,24:961-971.