MA Dongchu, SUN Yinghui,MA Xiaofeng, et al. General Hospital of Shenyang Military Area, Shenyang110015

【Abstract】ObjectiveTo explore the mechanism of sodium arsenite inducing apoptosis of NB4 cells. MethodsThe apoptosis of NB4 cells was studied by flow cytometry, DNA gel electrophoresis and Western blot analysis. Results①Sodium arsenite induced apoptosis of NB4 cells while the cells were arrested in G₂+M phase; ②dUTP-FITC specifically labeled NB4 cells in G₂+M phase after the cells were treated with sodium arsenite; ③After the treatment the expressions of cyclin A, E,D₁,D₂ and D₃ of the NB4 cells did not change significantly, while the expression of cyclin B₁ was up-regulated with prolongation of the treatment; ④Some of S phase NB4 cells expressed high level cyclin B₁ during the early period of treatment (16h), but most of NB4 cells expressing high level of cyclin B₁ were in G₂+M phase.ConclusionSodium arsenite selectively induced apoptosis of G₂+M phase NB4 cells, accompanied by upregulation of cyclin B₁.

【Key words】Cell line, NB4Sodium arseniteCell cycleCyclin B₁Apoptosis

最近，研究证实氧化砷可以选择性地诱导急性早幼粒细胞白血病（APL）细胞株NB4细胞凋亡^［1］，然而其作用机制不十分清楚。我们进一步研究发现,亚砷酸钠可以使NB4细胞在细胞周期的G₂+M期发生阻滞，并选择性地诱导阻滞在该期的NB4细胞凋亡，同时上调周期蛋白B₁(cyclin B₁）表达。现将研究结果报告如下。

材料和方法

1试剂三氧化二砷(As₂O₃)购自德国Merck公司。用1mol/L NaOH将As₂O₃溶解（以下称亚砷酸钠），调pH值至7.2，双蒸水调浓度至16mmol/L,贮存于室温待用。使用时用RPMI 1640培养液稀释。

2细胞培养以5×10⁵/ml的细胞浓度接种NB4细胞于含体积分数10%的胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养液中，37℃、饱和湿度、体积分数为5%的CO₂条件下培养，每周传代3次，所有实验均使用指数生长期的细胞。

3流式细胞仪分析细胞周期和凋亡细胞将处理细胞以1×10⁶/ml固定于体积分数为70%冷乙醇中，在4℃冰箱中过夜。PBS洗涤后，用含体积分数为0.002% Triton X-100,100U/ml RNase和50μg/ml碘化丙锭的染液染色，37℃,30分钟。FACSort流式细胞仪分析DNA含量，使用LYSYS^TMⅡ软件分析亚二倍体细胞数，使用Cell FIT软件分析细胞周期。

4免疫印迹法分析周期蛋白表达取1×10⁷细胞,用PBS洗涤两遍，以200μl裂解液(50mmol/L Tris-HCl,pH 8.0, 5g/L SDS,1mmol/L DTT)裂解,离心收集上清。用改良的RIPA缓冲液^［2，3］（含有2mmol/L EDTA,50mmol/L氟化钠，0.1mmol/L钒酸钠，1μg/ml 亮抑制肽和1μg/ml木瓜蛋白酶抑制剂)稀释，测蛋白质浓度。每个样品取10μg蛋白质在120g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳。将蛋白转移至硝酸纤维膜上，分别使用小鼠抗人周期蛋白A、B₁和E，大鼠抗人周期蛋白D₁、D₂和D₃单抗(美国Calbiochem公司)进行标记。膜经彻底洗涤后，用过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG或兔抗大鼠IgG（法国Immunotech公司)进行二抗标记。使用增强化学发光系统（英国Amersham公司)检测反应蛋白，X线胶片显影。

5DNA电泳处理细胞经PBS洗涤后，每1×10⁶个细胞加入350μl裂解液［10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0), 10mmol/L EDTA(pH 8.0), 75mmol/L NaCl, 5g/L SDS和0.15mg/ml蛋白酶K］,50℃孵育3小时。用酚和氯仿抽提DNA。沉淀的DNA溶于TE缓冲液，65℃孵育1小时, 加入RNase A(200μg/ml)，37℃继续孵育1小时。DNA在15g/L琼脂糖凝胶上电泳，60V,1小时。

6周期蛋白和DNA双标染色细胞用PBS洗涤2次，加入体积分数为70%冷乙醇，-20℃冰箱过夜。然后用无Ca²⁺、Mg²⁺的Hanks平衡盐液(HBSS, gibco)洗涤，加入含体积分数为0.25% Triton X-100的HBSS，冰浴5分钟。细胞用含0.1g/ml BSA的HBSS洗涤2次，加入10μl鼠抗人周期蛋白B₁单抗(100μg/ml，美国Calbiochem)，4℃冰箱过夜，细胞再与羊抗鼠IgG₁-FITC孵育1小时。洗涤后，用含有50μg/ml碘化丙锭、体积分数0.002% Triton X-100和100U/ml RNase的DNA染液染色30分钟。用FACSort流式细胞仪分析双标染色细胞，调节荧光补偿。数据经LYSYS^TMⅡ软件处理。

7原位杂交DNA链断端标记和DNA染色用原位细胞杂交检测试剂盒(法国BM公司)按文献［4］的方法标记DNA链断端。用碘化丙锭进行DNA染色。用FACSort流式细胞仪分析双染细胞，用LYSYS^TMⅡ软进行数据分析。

结果

1亚砷酸钠使NB4细胞阻滞在G₂+M期后诱导其凋亡图1显示在2μmol/L亚砷酸钠作用下，随着作用时间的延长，首先NB4细胞在细胞周期的G₂+M期发生阻滞，而后出现凋亡，作用40小时后发生凋亡的细胞为63.3%。在此过程中，G₁期和S期细胞明显减少。整个观察的作用时间范围内，NB4细胞的活性下降不明显，细胞数变化波动较大，甚至还有增加（图2），提示细胞周期阻滞不完全，也说明细胞处在两个同步化周期。

1～6依次为2μmol/L亚砷酸钠作用0，8，16，24，32和40小时

图1亚砷酸钠对NB4细胞周期分布及凋亡影响