关键词： 人参皂甙；造血细胞；信号传递；蛋白类，GATA-2

【摘要】目的探讨人参皂甙(GS)刺激造血祖细胞增殖有关的细胞内信号传递途径。方法采用Northern印迹杂交法、电泳带移动阻滞实验、抗体胶结合移动实验和紫外放射交联实验。结果Northern Blot显示经GS诱导的人巨核细胞株CHRF-288、Meg-01和MO7e细胞的GATA-2 mRNA水平增高，分别是未经处理细胞的1.84，2.43和1.52倍。但GATA-1 mRNA表达水平低，且GS处理前后也无明显变化。电泳带移动阻滞实验提示GS诱导的细胞核内GATA转录调控蛋白与特定的DNA序列结合的活性增高。抗体胶结合移动实验证实与DNA结合的主要成分为GATA-2蛋白，紫外放射交联实验确定该复合物的相对分子质量约为50×10³，符合GATA-2转录调控蛋白。结论GS诱导细胞内的信号传递途径与转录因子GATA-2有关，GATA-2有介导GS刺激造血细胞增殖的作用。

The intracellular signaling pathway initiated by ginsenosides in hematopoietic cells

GAO Ruilan, WU Chaoqun, BH Chong.Affiliated Hospital, Zhejiang College of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou310006

【Abstract】ObjectiveTo investigate that ginsenosides (GS) promotes proliferation of hematopoietic cells by virtue of the intracellular signaling pathway. MethodsThree human megakaryocytic cell lines and Northern blot analysis, electrophoretic mobility shift assay (EMSA), antibody gel supershift assay and UV-radiation cross-linking were used. ResultsAfter treatment with GS, GATA-2 mRNA levels in CHRF-288, Meg-01 and MO7e cells were increased by 1.84-,2.43-and 1.52- fold, respectively, while GATA-1 mRNA levels remained as low as pretreatment. GATA binding activities were elevated in all the three GS treated cell lines. The GATA binding complex appeared as a band with an approximate molecular weight of 50000 corresponding to the size of GATA-2 protein. ConclusionsThe intracellular signaling pathway initiated by GS was involved in transcription factor GATA-2. GATA-2 might play the key role in the GS induced upregulation of megakaryopoiesis.

【Key words】GinsenosidesHaematopoietic cellsSignaling pathwayProteins, GATA-2

我们曾报道人参皂甙(GS)可通过刺激正常人和再生障碍性贫血患者的红系、粒系祖细胞增殖而促进血细胞生成^［1］，但GS促使造血祖细胞增殖的作用机制尚未明了。GATA族蛋白是一组造血转录因子，现已发现6种，其中GATA-1、GATA-2和GATA-3在血细胞生成中起重要作用，它们的主要功能是介导造血细胞对生长因子的反应，参与细胞增殖及分化有关基因的调控^［2］。由于GS刺激造血的作用类似于生长因子，故借鉴研究生长因子的方法，探讨GS在造血细胞内的GATA信号传递途径。

材料和方法

1人巨核细胞株培养和GS刺激处理生长因子依赖细胞株MO7e由澳大利亚Hanson肿瘤研究中心LK Ashman博士惠赠，来自1例急性巨核细胞白血病婴儿的外周血。常规培养在含体积分数为15%胎牛血清，10ng/ml白细胞介素3(IL-3)的IMDM培养基中。非生长因子依赖细胞株CHRF-288购自美国ATCC，Meg-01细胞由日本Saito Nagoga医师惠赠，均常规生长在含体积分数为10%胎牛血清的培养基中，在加GS前，细胞作饥饿处理，MO7e细胞去除生长因子IL-3，在含体积分数为0.5%胎牛血清的培养基中培养18小时，CHRF-288和Meg-01细胞作无血清培养24小时，然后分别加入GS 50μg/ml或血小板生成素(Tpo) 30ng/ml，细胞与药物作用2小时后，提取总RNA或核蛋白。

2Northern 印迹杂交法按照Hamiton的方法^［3］，细胞经GS刺激处理后，用呱乙啶-氯化锶，超高速离心(30000r/min，20小时)的方法分离总RNA。总RNA在含甲醛的琼脂糖凝胶上进行RNA电泳，使RNA分子按大小不同而相互分开，然后用毛细吸管抽提原理，将RNA从琼脂糖凝胶转移到尼龙膜上(Hybond-N,Amersham)，用紫外光交联仪(Amersham)照射，使RNA固定在尼龙膜上。预杂交8小时，用α-³²P dCTP标记(Nick Translation)人GATA-1和GATA-2探针，并以GAPDH探针作对照，用放射性活度为6×10⁸Bq的质粒探针与载有RNA的膜杂交过夜(42℃)，常规洗膜，放射自显影，用NIH光密度扫描仪测定密度，求出GATA-1、GATA-2 mRNA的相对水平，用GAPDH作为内参校正，以除去实验误差。相同的Northern实验重复3次。

3提取核蛋白核蛋白提取方法按Dinam报道的加以改良，细胞经冷PBS洗涤后，悬浮在缓冲液A中，含蛋白酶抑制剂leupeptin、antipain、aprotinin和pepstatin(Sigma)，浓度均为10μg/ml，经振荡后使细胞膜破碎，收集细胞核，悬浮在缓冲液C中，超声粉碎器处理细胞核，12000r/min离心20分钟，取上清，测定蛋白浓度。

4电泳带移动阻滞实验(EMSA)将10μg核蛋白加入至20μl的反应液中［含HEPES、NaCl、EDTA、甘油、BSA和2.5μg/ml poly(dI/dC)］,于4℃作用15分钟^［4］。探针用具有与GATA-1、GATA-2、GATA-3转录因子共同结合位点的双链寡核苷酸，其序列为：5′-CACTTGATAACAGAAAGTGATAACTC-3′;3′-TGAACTATTGTCTTTCACTATTGAGA-5′。探针经末端标记法用α-³²P ATP(Amersham)标记后，测放射性核素每分钟闪烁计数值。稀释后取5μl探针(放射性核素每分钟闪烁计数值为50000)加入反应液中与核蛋白孵育30分钟，反应产物用60g/L聚丙烯酰胺不变性胶电泳分析，真空加热干燥后，用X线摄片放射自显影，即与特异性DNA结合的GATA转录因子的复合物(GATA binding complex)。相同的实验重复3次。

5抗体胶移动实验抗体胶移动实验与上述EMSA相同，但探针与核蛋白结合前先加入1.5μl(1mg/ml)的抗体(Santa Cruz^TM)到20μl反应混合液中，4℃孵育2小时，使抗原抗体结合，抗体为抗GATA-1(N6)、抗GATA-2(C-20)和抗GATA-3(HG3-31)，然后加入³²P-ATP标记的GATA核苷酸探针5μl后孵育30分钟，60g/L聚丙烯酰胺不变性胶电泳分析。

6紫外放射交联反应经GS刺激处理后，CHRF-288、Meg-01和MO7e细胞核中的GATA蛋白与DNA复合物进一步用紫外放射交联反应法分析。参照Tebo的方法^［5］，反应与EMSA相似，但用溴化尿嘧啶(BrdUTP)替代胸腺嘧啶(dTTP)合成双链DNA探针，再以α-³²PdCTP作缺口平移标记，将探针与标本混合在冰上用紫外光(波长254nm)照射30分钟，使探针与蛋白牢固结合，然后加入等量的SDS凝胶加样缓冲液，作SDS-PAGE电泳，真空加热干燥，放射自显影。

结果

1GS诱导GATA-2基因mRNA表达增加CHRF-288、Meg-01和MO7e细胞经饥饿和GS(50μg/ml)刺激处理后，提取总RNA。用Northern印迹法分析GATA-1、GATA-2基因的mRNA水平，经NIH图象扫描密度分析提示GS能够增加巨核细胞GATA-2基因mRNA表达水平，CHRF-288、Meg-01和MO7e经GS刺激后(见图1的1，3，5)GATA-2 mRNA水平分别是未经GS处理(图1的2，4，6)的1.84,2.43和1.52倍。但是这三株细胞的GATA-1 mRNA表达水平均明显低于GATA-2，且对GS刺激的反应也不明显。以上结果提示GS刺激巨核系祖细胞增殖作用与GATA-2有关。

1，2：CHRF-288；3，4：Meg-01；5，6：MO7e

图1Northern blot分析GS刺激后GATA-2 mRNA表达水平

2GS诱导的GATA转录因子与DNA结合活性用³²P标记GATA寡核苷酸探针，经EMSA的方法检测GATA蛋白与DNA结合的复合物。作为阴性对照的Hela细胞经GS或Tpo刺激处理后均没有显示GATA蛋白与DNA结合的复合物，即没有出现特异性带。而CHRF-288、Meg-01和MO7e三株细胞经GS刺激后均显示明显的GATA蛋白与DNA结合的特异性带(见图2)，提示GS诱导GATA转录因子与特异性DNA结合的活性均高于未经处理的细胞。同时经Tpo处理后，CHRF-288和Meg-01细胞的GATA结合活性没有明显增高(图2)，因为它们为非生长因子依赖细胞，对低浓度的Tpo敏感性低。而生长因子依赖MO7e细胞则显示出对同样浓度的Tpo刺激有反应。此外，这条GATA与DNA复合物的带可被浓度为5～100倍的未经同位素标记的探针竞争性地结合而逐渐消失(图中没有显示)也说明其特异性。

1：Hela细胞；2～4：CHRF-288细胞；5～7：Meg-01细胞；8～10：MO7e细胞

图2电泳带移动阻滞实验显示GS诱导的GATA转录因子

与DNA结合的活性

3抗体胶移动实验分析GS诱导的GATA与DNA结合的复合物成分EMSA结果显示了GS诱导的GATA与DNA的结合情况，为了分析这条特异性带的成分，加入3种抗体GATA-1、GATA-2和GATA-3作抗体胶移动实验。结果显示三种细胞的GATA与DNA结合复合物均主要被GATA-2抗体特异性结合，使之上移<