关键词： 基因,PML-RARα；细胞系，NB4；寡核苷酸，反义

【摘要】目的合成针对长型PML-RARα融合基因mRNA起始部位和融合位点的反义核酸(AS)，探讨AS的稳定性、特异性及其对NB4细胞生长、凋亡的影响。方法以NB4细胞株为研究对象，采用台盼蓝拒染法进行细胞计数；聚丙烯酰胺凝胶进行寡核苷酸的电泳；流式细胞仪、DNA电泳、细胞荧光染色进行细胞凋亡检测。结果合成的AS稳定、耐细胞内外核酸酶、无非特异性作用；起始部位AS（STAS)和融合位点AS(FUAS)明显抑制细胞增殖，且呈剂量依赖性。浓度20μg/ml时增殖抑制率0%～11.3%；80μg/ml时，抑制率50.0%～67.7%。FUAS（60μg/ml）处理第7天、第9天出现明显的凋亡细胞群，处理后3天、5天、7天、9天的凋亡细胞率分别为9.3%、24.5%、41.0%、34.2%。结论针对长型PML-RARα融合基因的AS设计、合成是成功的；抗PML-RARα AS能抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。

Design and synthesis of anti-PML-RARα antisense and its effects on the growth and apoptosis of NB4 cells

CHEN Ye, MIAO Jinming, ZHU Xuehong，et al. Shanghai Institute of Hematology, Laboratory of Leukemia Research,Renji Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai200001

【Abstract】ObjectiveTo synthesize antisense oligodeoxynucleotides (AS) targeting the fusion point region (FUAS) and the start codon region (STAS) of the long type PML-RARα mRNA and investigate its stability, specificity and effects on the growth and apoptosis of NB4 cells. MethodsNB4 cell apoptosis was assayed by flow cytometry, cell-fluorescence and DNA gel electrophoresis. Trypan blue exclusion was used for cell counts, and polyacrylamide gel electrophoresis for oligodeoxynucleotides. ResultsThe synthesized 18bp phosphorothioate oligodeoxynucleotides was stable, resistant to nuclease, and no unspecific effects. Both STAS and FUAS could inhibit the NB4 cell growth in a dose-dependent manner. Low concentration (20μg/ml) of STAS or FUAS resulted in growth inhibition of 0%～11.3%， and the highest inhibition was found at concentration of 80μg/ml (inhibition rate 50.0%～67.7%). Cell DNA content analyzed by flow cytometry showed the typical profile of apoptotic cells at 7th day, 9th day of treatment with FUAS. Percentages of apoptotic cells in fUAS-treated cells was 9.3%, 24.5%, 41.0% and 34.2% after 3,5,7 and 9 days of FUAS treatment, respectively. ConclusionSTAS and FUAS successfully synthesized and both of them could inhibit the growth and induce the cell apoptosis of NB4 cells.

【Key words】Genes, PML-RARαCell line, NB4Oligonucleotides, antisense

反义核酸(antisence，AS)技术是通过反义寡核苷酸与靶基因结合来达到抑制癌基因表达的目的。AS的互补链可以是基因 DNA或mRNA。目前报道的体内外实验都是首选 mRNA。针对mRNA最常见的靶序列是翻译起始部位及附近的密码子或融合基因的融合位点密码子。急性早幼粒细胞白血病

（APL)有t(15;17)，产生的特征性PML-RARα融合基因为AS技术的建立提供了一个理想的范例。t(15;17)中，17号染色体的断裂点总是出现在 RARα基因的第2个内含子^［1,2］，15号染色体的断裂点则可能出现在PML基因的3个不同区域，即第6内含子(bcr-1)、第3内含子(bcr-3)、第6外显子(bcr-2)，相应的PML-RARα蛋白可分为长型(L型)、短型(S型)和变异型三种。NB4细胞株cDNA序列^［3］与长型PML-RARα cDNA一致,因此，我们采用针对长型PML-RARα mRNA的反义寡核苷酸进行研究。

材料和方法

1AS的设计和合成根据AS设计的原则，选择长型PML-RARα mRNA的翻译起始部位和融合位点作为靶位点合成AS。起始部位反义寡核苷酸(STAS)、融合部位反义寡核苷酸(FUAS)，分别与PML-RARα cDNA起始部位和融合部位序列互补，另设正义链寡核苷酸(Sen,序列与融合部位序列cDNA一致)、随机寡核苷酸(Ran)作为对照组。所有实验均分为STAS、FUAS、Sen、Ran、空白对照共5组。寡核苷酸合成序列如下：

STAS序列：5′-GGTCTCGGGAGGCAT-3′；

FUAS序列：5′-CTCAATGGCTGCCTCCCC-3′；

Sen序列：5′-GGGGAGGCAGCCATTGAG-3′；

Ran序列：5′-GAAGGGCTTTTGAACTCT-3′。

所有寡核苷酸均由Sangon公司用PE公司391型DNA合成仪合成，并经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化。寡核苷酸的碱基均进行硫化修饰，即寡核苷酸磷酸二酯键内非连接氧被硫替代。

2寡核苷酸配制寡核苷酸用不含小牛血清的RPMI 1640培养液溶解，浓度为1μg/ml,临用前配制或配制后置-20℃低温保存。

3细胞培养NB4细胞株由上海血液学研究所陈竺教授提供。细胞悬浮生长于RPMI 1640培养液(购自Gibco公司)中，内含体积分数为15％的小牛血清(56℃灭活30分钟，购自上海第二医科大学分部)、1mmol/L谷胺酰胺、1mmol/L丙酮酸及青霉素和链霉素各100U/ml，于37℃、体积分数为5％的CO₂湿空气中培养。以初始细胞浓度为0.5×10⁵/ml的培养液接种于96孔板，每孔加含细胞的培养液0.2ml，分别将4种寡核苷酸以20，30，40，60，80μg/ml 5种不同终浓度加入NB4细胞培养液中，孵育18小时后再追加初始浓度的一半剂量，同时设空白对照，即不加任何寡核苷酸作用的NB4细胞培养物。于孵育后第2，3，4，5，6天收集细胞进行检测。

4细胞计数采用台盼蓝拒染、计数板计数法。

5变性PAGE聚丙烯酰胺凝胶浓度为16g/L，用于寡核苷酸电泳。

6细胞DNA电泳用常规酚-氯仿抽提法抽提DNA，20g/L琼脂糖上样电泳，电压80V，3小时,溴化乙锭(EB)染色，紫外反射透色仪观察，照相。

7流式细胞仪(FCM)检测收集培养细胞5×10⁵，用冷的PBS洗2次；加入冰无水乙醇固定，边加边摇，乙醇的终浓度控制在体积分数70％左右，-20℃保存至少24小时；测试当天，取上述-20℃保存的固定细胞，2000r/min离心5分钟，用 PBS洗2次；细胞悬浮于1ml PBS缓冲液中，加10g/L RNA酶100μl，混匀，室温放置10分钟；加入含Triton X-100的碘化丙锭(PI， 50mg/ml)，PI的终浓度为25mg/ml，低温30分钟，过滤后上机(FACScan,Becton Dickinson, USA)检测。所有资料经 LysysⅡ软件、Celfit软件收集、储存和分析。

8细胞荧光染色检测取寡核苷酸处理过的NB4细胞培养液25μl，加1μl荧光染色液（由3种DNA荧光染料CO，CY，CN制成，美国李彪如教授赠送）混匀；取10μl混合物置载玻片上，盖上盖玻片。于荧光显微镜下观察并计数 200个以上细胞，计数凋亡细胞百分率。判断标准：活细胞为绿色，凋亡细胞为橙红色，坏死细胞为均匀淡红色。

结 果

1寡核苷酸的稳定性将4种寡核苷酸溶解于无BSA的RPMI 1640培养液中，取少量-20℃保存5个月，然后进行变性PAGE。低温存放5个月的寡核苷酸溶液与临用前配制的无差异，提示硫代磷酸型寡核苷酸在RPMI 1640培养液中能完全溶解，低温放置较长时间也未见降解。为了解硫代磷酸型寡核苷酸在血清中的稳定性，4种寡核苷酸分别与含体积分数为10％的小牛血清的RPMI 1640培养液(终浓度200μg/ml)孵育72小时，取10μl进行变性PAGE，结果表明硫代磷酸型寡核苷酸在血清中相当稳定。

2不同浓度AS对NB4细胞生长的影响用不同浓度STAS、FUAS、Sen、Ran处理NB4细胞，结果提示Sen组、Ran组对细胞的生长几乎无影响，高浓度(80μg/ml)时，对细胞的增殖有轻度(0%～18.6%)的抑制作用(见图1)；STAS组、FUAS组明显抑制细胞增殖，低浓度(20μg/ml)时STAS组、FUAS组对细胞的生长抑制率为0%～11.3%, 80μg/ml时STAS组、FUAS组对细胞增殖的抑制作用最强，最大抑制率分别为67.7%和59.2%，抑制作用从第2天即出现，第4天达高峰。60μg/ml时STAS组、FUAS组对细胞增殖的最大抑制率分别为58.9%和46.8%，但Sen组、Ran组的细胞增殖情况与空白对照组无明显差异。

图14种寡核苷酸对NB4细胞株生长的抑制作用(n=3)

3抗PML-RARα AS处理后NB4细胞内DNA含量的变化及细胞凋亡的检测60μg/ml寡核苷酸处理的NB4细胞株，用 FCM分析细胞内DNA含量的变化。结果显示空白对照组为正常的二倍体峰； Sen、Ran组未见峰型的改变；FUAS处理后第7天、第9天出现明显的凋亡细胞群，即G₁峰前出现亚二倍体峰。凋亡细胞峰的百分率基本上代表在总的细胞中发生凋亡的细胞百分率。FUAS处理后第3，5，7，9天的凋亡细胞百分率分别为9.3%，24.5%，41.0%，34.2%。荧光染色检测的凋亡细胞百分率与FCM检测结果基本一致(见表1)。

表1寡核苷酸处理后不同时间FCM及<