HL-60为髓系白血病传代细胞，在诱导分化的条件下，可向粒细胞及单核细胞分化。到目前为止，未见到该细胞可向B细胞分化及产生免疫球蛋白(Ig)的研究报道。然而，我们在探讨癌细胞内的Ig样蛋白表达情况时，偶然发现HL-60细胞内也同多种上皮来源的肿瘤细胞一样^［1］，存在着Ig样蛋白及Ig基因的重排序列。

材料和方法

1材料HL-60、Raji(B细胞性淋巴瘤传代细胞)为本实验室传代的细胞；羊抗人IgG-FITC购于日本Cappel公司，羊抗鼠Ig-FITC购于Immunotech公司；3条引物，为用于扩增IgH V-D-J片段的引物，其中引物1(FR3A)：5′-ACACGGC(C/T)(G/C)TGTATTACTGT-3′为V区的保守区(FR3)互补序列，引物2(LJH)：5′-TGAGGAGACGGTGACC-3′为J区(FR4)的互补序列；引物3(VLJH)：5′-GTGACCAGGGT(A/G/C/T)CCTTGGCCCCAG-3′为引物2的5′端的互补序列由赛百盛公司合成；PGEM easy T载体购于Promega公司。

2细胞培养用RPMI 1640培养基加体积分数为10%的新生牛血清培养。

3荧光标记及流式细胞仪(FACS)检测收集生长状态良好的HL-60、Raji细胞，用PBS洗后，用体积分数为1%的甲醛缓冲液(含0.5g/L的NP-40、10g/L BSA)固定30分钟，用抗人IgG-FITC标记细胞内Ig样蛋白，同时用羊抗鼠Ig-FITC作对照，PBS洗后，FACS检测。

4基因组DNA的提取，按常规方法操作。

5PCR扩增IgH V-D-J片段用半套式PCR方法，即第一次扩增用引物1和引物2，第二次扩增时以第一次扩增产物为模板，用引物1和引物3，详见文献［2］。所用的DNA模板除HL-60、Raji DNA外，用T47-D(乳腺癌传代细胞系)DNA作为阴性对照^［2］。

6PCR产物克隆到PEGM easy T载体上HL-60的PCR产物用电泳切胶后反复冻融法纯化，按试剂盒说明书将其克隆到PEGM easy T载体上，然后将其转化JM 109大肠杆菌，进行蓝白斑筛选。

7限制性内切酶鉴定及核苷酸序列分析提取阳性克隆的重组质粒，用EcoR Ⅰ进行酶切鉴定，然后测定核苷酸序列(由中国科学院微生物研究所完成)。

结果

1FACS检测无论是Raji还是HL-60细胞抗人IgG-FITC组的阳性细胞百分率与抗鼠IgG-FITC组相比都明显增高，其中，Raji细胞的抗鼠IgG-FITC组为2.3%，与自发荧光组相比差异不明显；抗人IgG-FITC组为29.4%，与抗鼠IgG-FITC组及自发荧光组相比差异明显。HL-60细胞的抗鼠IgG-FITC组阳性率为2.7%，与Raji相比差异不明显；而抗人IgG-FITC组阳性率为59.7%，高于Raji细胞。

2PCR检测PCR扩增后的产物，经30g/L琼脂糖凝胶电泳后发现，HL-60的PCR产物在80～90bp出现一条单克隆带，较Raji细胞的阳性片段稍短(见图1)。T47-D未见阳性带．

M：Marker;2:Raji细胞; 3:HL-60细胞；4：T47-D细胞

图1PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析结果

3PCR产物序列测定HL-60的PCR产物为83bp，与已知Ig基因可变区进行同源性分析后发现，该序列的5′端及3′端分别为FR3及FR4序列，而CDRⅢ区除8个核苷酸与D3～10、D3～16同源外，与其它已报道的D区未见同源(见图2)。

讨论

HL-60为髓系白血病传代细胞，而目前的免疫学理论认为Ig基因重排只发生在B细胞发育的过程中，在其它造血细胞及体细胞不发生重排，因此，也就不应该有Ig的产生。而我们在探讨上皮恶性肿瘤细胞内Ig样蛋白的同时，也对HL-60细胞进行了观察，结果发现，HL-60细胞内同样存在与Ig抗原性相同的物质，特别是PCR检测时同样发现了Ig基因重排后片段，说明Ig基因在HL-60细胞内发生了重排。

目前的研究已经发现，在T、B淋巴细胞瘤细胞之间，Ig基因与TCR基因的

2PCR产物序列交叉表达中是普遍的现象^［3］，

一般认为Ig基因与TCR基因在发生重排的过程中，都依赖同一种重组酶的作用，在肿瘤发生的早期，由于重组酶的过表达，有可能两种基因都发生了重排。然而HL-60细胞作为髓系白血病细胞为什么出现Ig基因重排诱导重排的机制是什么还无从解释。目前虽然没有与本实验结果相同的报道，但相关的一些研究已经发现，一些髓系白血病细胞包括HL-60细胞有Ig基因μ链的转录^［4］，并将这一结果解释为髓系白血病可能发生在细胞分化的早期，与淋巴系白血病的发生关系密切。我们的实验表明，HL-60细胞的PCR结果与阳性对照Raji细胞相比，其可重复性非常好，提高复性温度不影响实验结果，说明其与引物的互补程度较高。因为所用的引物其5′端与可变区的第三个保守区(FR3)互补；3′端与可变区的第四个保守区(FR4)互补，当分析其序列时发现，这一PCR片段从两侧引物核苷酸序列开始看，具有完整的FR3、4序列。但其CDRⅢ除8个核苷酸与D3～10、D3～16同源外，具有独特的核苷酸序列，根据上述结果我们认为细胞内的这种Ig样蛋白是属于Ig。

HL-60 Ig样蛋白的表达量，与上皮来源的肿瘤细胞相比较低，由于免疫荧光法较免疫酶法敏感，所以，尽管通常用FACS检测时，其荧光强度较强，但用免疫酶法检测经常出现阴性反应，而大部分的上皮性肿瘤细胞不管是免疫酶或免疫荧光都呈明显的阳性反应。但将HL-60细胞与阳性对照Raji比较时发现，其阳性细胞百分率高于Raji细胞近2倍。

本课题受国家教委留学人员科研启动基金资助

参考文献

［1］］邱晓彦，杨贵贞. 恶性肿瘤细胞内呈现的Ig样蛋白特性及Ig基因结构分析. 中国免疫学杂志，1996，5：296.

［2］邱晓彦，杨贵贞. 上皮性恶性肿瘤细胞的Ig基因分析. 中国肿瘤生物治疗杂志，1997，4：157-158.

［3］Kitchingman GR，Rovigatti U, Mauer AM, et al. Rearrangement of imunoglobulin heavy chain genes in T cell acute lymphoblastic leukemia. Blood, 1985, 65:725-729.

［4］Williams L, Moscinski LC, Medveczky PG. Immunoglobulin germline μ transcripts in acute myelogenous leukemia cells vary in splicing pattern and are heterogeneous. Leukemia, 1995, 9:2016-2022.

收稿：1998-05-01

修回：1998-08-17