关键词： 血小板因子4；造血；氟尿嘧啶；造血保护作用

【摘要】目的了解血小板第4因子(PF4)和四肽N-乙酰-丝-天-赖-脯(AcSDKP)对5-氟尿嘧啶(5-FU)处理后小鼠体内造血的作用。方法实验鼠用PF4(40μg/kg)或AcSDKP(4μg/kg)注射2次，间隔6小时，第2次注射后20小时再注射5-FU(150mg/kg)。第6，8和13天时，检查高增殖潜能的集落形成细胞(HPP-CFC)、红系爆式集落形成单位(BFU-E)、粒-巨噬系集落形成单位(CFU-GM)、巨核系集落形成单位(CFU-MK)及巨核细胞(MK)。结果PF4或AcSDKP可促使6～8天的HPP-CFC以及8天的BFU-E和CFU-GM明显增加；PF4还能促进8天的CFU-MK和MK增加，但AcSDKP则无此作用。结论PF4和AcSDKP虽然对巨核祖细胞的作用不同，但它们均能加速体内HPP-CFC、CFU-GM和BFU-E的恢复，这两种分子有可能具有保护造血细胞抵抗化疗药物杀伤的作用。

The hemoprotective effect of platelet factor 4 (PF4) and tetrapeptide AcSDKPHAN Zhongchao, CAI Yinglin, S Aidoudi, et al.The State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology, CAMS and PUMC, Tianjin300020

【Abstract】ObjectiveTo study the effects of platelet factor 4(PF4) and tetrapeptide N-acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro(AcSDKP) on hemopoietic progenitors in mice treated with 5-Fluorouracil (5-FU).Methods Mice were injected with PF4 (40μg/kg) or AcSDKP (4μg/kg) twice at 6h intervals, and 20h after the second injection they were given one injection of 5-FU (150mg/kg),and the high proliferative potential-colony forming cell (HPP-CFC), burst-forming unit erythroid (BFU-E), colony forming unit megakaryocyte (CFU-MK), and megakaryocyte (MK) were examined 6,8 and 13 days later. Results The administration of PF4 or AcSDKP resulted in a significant increase of the number of HPP-CFC on days 6～8 and BFU-E and CFU-GM on day 8 when compared to 5-FU alone. Furthermore, PF4 was found to increase significantly the number of CFU-MK and MK on day 8, which was not observed with AcSDKP.Conclusion PF4 or AcSDKP accelerate the recovery in vivo of HPP-CFC, CFU-GM and BFU-E after 5-FU treatment but their effect may be different on megakaryocytic progenitors. Both molecules may have a hemoprotective effect against chemotherapeutic agents.

【Key words】Platelet factor 4HemopoiesisFluorouracilHemoprotection

血小板第4因子(PF4)是巨核系造血的有效抑制剂，能使小鼠巨核细胞(MK)和血小板生成明显抑制。实验还发现PF4能抑制正常和血小板减少患者中巨核细胞及其祖细胞的生长^［1，2］。PF4对CD₃₄⁺细胞向巨核细胞系分化的抑制作用是可逆的，能增加未成熟的祖细胞和5氟尿嘧啶(5-FU)抗性细胞^［3］。我们利用PF4这种活性，假设PF4可以保护祖细胞避免细胞周期特异性药物的毒性，依此进行了实验并比较了它和四肽N-乙酰-丝-天-赖-脯(AcSDKP)对5-FU处理鼠的造血调节作用。

材料和方法

1小鼠6～8周的BALB/c雄性小鼠，购自法国IFFA实验室，在标准条件下喂养。

2试剂高纯度人PF4由法国Dianostica Stago公司提供，四肽AcSDKP来自法国Ipson-Biotech公司。重组鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和白细胞介素3(rmIL-3)由法国Beite-Kaito公司提供，重组人红细胞生成素(Epo)为德国Boeringer公司产品，5-FU购自法国Roche公司。

3小鼠的处理用PF4(40μg/kg)或AcSDKP(4μg/kg)或PBS注射小鼠2次，间隔6小时，第2次注射后20小时，用5-FU(150mg/kg)注入小鼠腹腔。在6，8和13天时用颈脱位法处死小鼠，从股骨收集骨髓细胞，用α-培养液(α-MEM)洗细胞，1200×g离心10分钟后，计数单个核细胞(MNC)。

4高增殖潜能集落形成细胞(HPP-CFC)及巨核细胞集落形成单位(CFU-MK)测定按文献［4］所述的血浆凝块培养法，略有改动。将5×10⁴骨髓有核细胞培养在1ml α-MEM中，培养液含有体积分数为10%柠檬酸盐处理的牛血浆(Gibco公司)、1% BSA(Sigma公司)、1×10^-4mol/L 2-巯基乙醇(Sigma公司)、0.34mg CaCl₂及体积分数为5%再生障碍性贫血猪血清(AAS，由8Gy全身照射后5天的猪血中收集)。培养30分钟后，凝块形成，三分之一的平皿用滤纸吸干，用体积分数为1%多聚甲醛固定，再用乙酰胆碱酯酶染色，确定巨核细胞的数目。其它的平皿置于37℃、体积分数为5% CO₂培养箱内孵育7天后，其中4个平皿用体积分数为1%多聚甲醛固定，乙酰胆碱酯酶染色，检测CFU-MK。培养13天后，5个平皿用同法固定，在乙酰胆碱酯酶和苏木精染色后计算HPP-CFC集落。

5红系爆式集落形成单位(BFU-E)及粒-巨噬系集落形成单位(CFU-GM)测定将10⁵或4×10⁴/ml的骨髓MNC(分别用于BFU-E和CFU-GM测定)植入半固体培养基中,培养基含有0.8%甲基纤维素、体积分数为20%胎牛血清、 5ng/ml rmIL-3、 4U/ml Epo(用于BFU-E测定)和5ng/ml rmGM-CSF(用于CFU-GM测定)。每次实验的培养物均一式四份,在37℃、体积分数为5% CO₂培养箱中孵育8天,然后在倒置显微镜下计数BFU-E及CFU-GM。

结果

1骨髓MNC单一剂量5-FU(150mg/kg)给药,在第6天MNC减少大约(96.0±0.1)%。第8天MNC数目有所回升,直至13天仍维持在低于对照组的水平。而给予PF4或AcSDKP,在第6,8和13天时,MNC的数目与单用5-FU处理组相似(图1)。

图1PF4和AcSDKP对小鼠MNC数目的影响

2HPP-CFC5×10⁴细胞培养在1ml培养液中,得到大约10个HPP-CFC/股骨。图2表明，第6，8和13天时5-FU处理小鼠的HPP-CFC增加,合并使用PF4或AcSDKP的小鼠, 第6和第8天的HPP-CFC增加更明显,而第13天的HPP-CFC则与单独5-FU处理组无明显差别。

图2PF4和AcSDKP对小鼠HPP-CFC数目的影响

3CFU-GM图3显示给予5-FU后6天,所有小鼠(每组4～5只)CFU-GM数目减少92%左右。第8天时,单独5-FU处理小鼠CFU-GM数目开始回升,而合并PF4或AcSDKP组CFU-GM的数目回升更明显,两者之间差异有显著性(P＜0.005)。

图3PF4和AcSDKP对小鼠CFU-GM数目的影响

4CFU-MK图4显示5-FU处理后6天,与对照组相比较,所有经5-FU处理鼠的CFU-MK数目大约减少30%；而第8和13天, CFU-MK数目可增加2倍。给PF4组第8和13天, CFU-MK增加更显著，第8天,PF4组与单独5-FU处理组相比,差异在统计学上有非常显著意义(P＜0.0005),而AcSDKP组与对照组比较，则差异无统计学意义。

图4PF4和AcSDKP对小鼠CFU-MK数目的影响

5BFU-E图5显示，给予5-FU后8天,与对照组比, BFU-E数目减少大约40%。给AcSDKP或PF4组与单独5-FU处理组比, BFU-E数目增加明显。

图5PF4和AcSDKP对小鼠BFU-E数目的影响

6MK图6所示, 5-FU处理后6天,与对照组相比, MK数目大约减少50%, 第8和13天时则有所增加。PF4组第8天时MK的数目显著增加(P＜0.02),而第13天时则与5-FU组差别不明显。AcSDKP组,无论第8天还是第13天，MK的数目与单用5-FU组相比,差异均无显著性。

图6PF4和AcSDKP对小鼠MK数目的影响

讨论

5-FU是已知作用于细胞周期的特异性药物,能杀伤增殖的造血祖细胞,而相对使处于静止状态的造血干细胞增加。小鼠HPP-CFC是第1个被确定为在体内抵抗5-FU的造血干细胞,具有在骨髓移植后长期存活的能力。本实验显示了5-FU合用PF4及AcSDKP可使HPP-CFC数目增加,证明两种物质对造血干细胞有作用。PF4和AcSDKP也使CFU-GM和BFU-E增加。但是它们对巨核细胞系的作用是不同的, PF4能作用于巨核系祖细胞和巨核细胞。

PF4和AcSDKP加速造血祖细胞的恢复是由于保护还是刺激细胞,尚有待进一步研究。PF