关键词： 受体,转铁蛋白；亚铁螯合酶；白血病,幼红细胞,急性；细胞系；RNA

【摘要】目的通过对MEL细胞在二甲基亚砜(DMSO)诱导分化前后和不同的铁状态，观察转铁蛋白受体(TfR) mRNA和铁螯合酶mRNA含量的变化。方法 MEL细胞体外培养，加DMSO向红系诱导分化，同时以未诱导细胞为对照，应用 northern blot检测TfR mRNA和铁螯合酶mRNA含量，观察加入转铁蛋白、去铁胺或抗TfR单抗和Epo后的作用。结果和结论①未诱导的MEL细胞，随着细胞的增殖，TfR mRNA含量增加； 诱导的MEL细胞，虽然随着细胞分化成熟而丧失增殖能力，但当存在血红素合成时，TfR mRNA含量也增高，且增高幅度较非诱导组高。②未诱导的MEL细胞，降低细胞内铁含量(培养液中加入去铁胺或抗TfR单抗 )，可刺激TfR mRNA表达，增加细胞内铁含量(培养液中加入转铁蛋白)，则抑制TfR mRNA的表达；诱导的MEL细胞，相同条件的铁状态时，细胞内TfR mRNA水平发生类似的改变，但变化的程度较小。③当培养液中加入Epo刺激红系细胞分化时，促进TfR mRNA的表达。上述结果提示，在红系细胞，TfR mRNA的表达除受细胞内铁调节外，也受细胞内血红素合成的影响。④未诱导的MEL细胞，虽然细胞增生旺盛，但铁螯合酶mRNA表达无变化;诱导的MEL细胞，铁螯合酶mRNA表达显著增加。⑤在诱导和未诱导的MEL细胞，铁对铁螯合酶mRNA表达的影响均较弱。

Expression of transferrin receptor and ferrochelatase mRNAs in MEL cellsWANG weiliang，LI rongsheng， CHEN jialin，et al. Department of Hematology, Peking Union Medical College Hospital, Beijing100730

【Abstract】ObjectiveTo investigate the changes of transferrin receptor (TfR) mRNA and ferrochelatase mRNA levels under different iron status of DMSO induced or non-induced MEL cells.MethodsMEL cells were induced with 1.5% DMSO. TfR mRNA and ferrochelatase mRNA were assayed by Northern blot after adding transferrin, deferrioxamine, anti-TfR monoclonal antibody (McAb) or Epo, respectively.Results and conclusion①TfR mRNA level increased with cell proliferation in non-induced MEL cells, while in the induced MEL cells, although the proliferating capacity was losing with cell maturation, TfR mRNA level increased with hemoglobin synthesis and its amplitude was higher than that in non-induced cells. ②In both non-induced and induced MEL cells, TfR mRNA levels increased when intracellular iron level decreased; and vice versa. ③Stimulation of erythropoiesis by Epo increased the expression of TfR mRNA, indicating that its expression in erythroid cells was regulated by the level of intracellular iron and the synthesis of heme. ④The expression of ferrochelatase mRNA had no change in non-induced MEL cells, but increased significantly in induced MEL cells. ⑤The level of intracellular iron in non-induced and induced MEL cells had less effects on the expression of ferrochelatase mRNA.

【Key words】Receptors, transferrinFerrochelatase leukemia,erythroblastic, acute Cell line RNA

几乎所有的细胞均可合成血红素，但在红系和非红系细胞，血红素生物合成的调节机制是不相同的。在非红系细胞，氨基乙酰丙酸合成酶(ALAS)是血红素合成的限速酶，血红素可反馈地抑制ALAS的活性，但在红系细胞，血红素并不反馈抑制ALAS的活性。Ponka等^［1］发现，在红系细胞，铁的摄取是血红素合成的关键。Fadigan和Dailey^［2］根据他们对Friend细胞的研究结果，认为铁螯合酶是血红素合成的限速酶，胞浆内铁通过对它的调节而影响血红素的合成。

在红系细胞，铁主要被用于合成血红蛋白。红系细胞摄取铁的能力完全取决于转铁蛋白受体(TfR)的表达量。人体70%以上的铁被红系细胞用于合成血红蛋白。伴随着细胞的分化成熟，红系细胞逐渐丧失增殖能力，与此同时，由于血红蛋白合成的增加，细胞对铁的需求增加，这种与细胞增殖状态无关的TfR高表达的机制显然不同于非红系细胞。

Friend小鼠红白血病(Friend murine erythroleukemia, MEL)系统是体外研究红系细胞分化成熟最常用的模型。MEL系统是由Friend病毒感染小鼠脾脏细胞而建立的细胞株,即鼠红白血病细胞株。在培养液中加入二甲基亚砜(DMSO)等诱导剂后，MEL细胞可逐渐向红系细胞分化成熟，其分化过程与体内红系细胞的分化相同。在MEL细胞诱导分化过程中，出现血红素合成途径中的各类酶水平增加,细胞表达TfR和铁摄入增加，且有珠蛋白基因表达。我们通过观察对MEL细胞诱导前后，铁对TfR mRNA和铁螯合酶 mRNA 表达水平的影响，以探讨铁、TfR与铁螯合酶三者之间的关系。

材料和方法

1试剂转铁蛋白(Tf)、DMSO和RPMI1640培养液购自Sigma公司。抗TfR单克隆抗体(TfR-McAb)购自Coulter公司。去铁胺购自Ciba公司。α-³²P-dCTP［0.1MBq/mol(3000μCi/mmol)］购自DU pont公司。Epo由Amgen公司赠送。TfR cDNA探针由Kuhn博士(瑞士Institut suisse de Recherchessur Lecancer)惠赠。铁螯合酶cDNA探针由Taketani博士(日本Kansai medical University)惠赠。β-actin cDNA探针由国家计划生育委员会科学研究所分子生物室(美国NIC hD Chou博士)惠赠。

2细胞培养MEL细胞以一定密度(1×10⁵/ml)接种于含有体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养液的100ml玻璃培养瓶中，在37℃培养箱，体积分数为5%的CO₂条件下培养。据实验要求，在RPMI1640培养液中加入或不加入DMSO及相关试剂(Tf, TfR-McAb 和去铁胺)。分别培养0,24,48,72,96小时，收集细胞提取RNA。

3RNA提取和检测细胞总RNA的提取采用异硫氰酸胍一步法^［3］。RNA的质量鉴定用DU-7紫外分光光度计测定RNA样品在波长为260nm和280nm的吸光度(A)值。根据A值计算样品的RNA浓度及纯度：A₂₆₀∶A₂₈₀＞1.8，表明样品中蛋白质及酚去除干净。 northern-blot法^［4］检测mRNA，用乙二醛和DMSO变性的RNA电泳，将RNA转移至尼龙膜上。探针标记采用随机引物法将α-³²P-dCTP标记到探针上。将固定于尼龙膜上的RNA与放射性标记的探针进行杂交并放射自显影。β-actin作为内对照。

结果

1MEL细胞诱导分化前后TfR mRNA水平的变化未经诱导的MEL细胞，不足1%的细胞可自发性进行分化或出现血红蛋白的合成。图1示未经体积分数为1.5%的DMSO作用的MEL细胞所表达的TfR mRNA水平。TfR mRNA大小约为5kb，在开始培养的48小时内，TfR mRNA水平呈轻度至中度增高，但在培养48～96小时后，TfR mRNA水平逐渐下降；MEL细胞经DMSO诱导分化后,TfR mRNA的大小约为5kb，随着培养时间的增加，TfR mRNA呈稳定增长趋势，在培养3～4天，相对于培养初期，TfR mRNA水平增长3～4倍。在整个培养过程中，β-actin mRNA水平呈相对稳定状态。

图1MEL细胞在DMSO诱导前后TfR mRNA比较

2DMSO对铁螯合酶 mRNA表达水平的影响图2示MEL细胞在经诱导分化前后铁螯合酶mRNA水平的变化。MEL细胞经体积分数为1.5% dMSO诱导后逐渐丧失增殖能力，在诱导后的第3天，MEL细胞开始合成大量的血红蛋白，至诱导的第4天，90%以上的细胞均出现合成大量血红蛋白。

图2MEL细胞在DMSO诱导前后铁螯合酶mRNA比较

3铁对TfR mRNA表达水平的影响在MEL细胞经或未经体积分数为1.5%的DMSO诱导培养过程中，加入各种试剂以改变细胞内铁含量。培养液中铁含量以铁蛋白为标准。图3示MEL细胞诱导前后，在细胞内不同铁状态时，细胞表达TfR mRNA的水平。

图3不同铁状态下MEL细胞在DMSO诱导前后TfR mRNA比较

4铁对铁螯合酶mRNA表达水平的影响图4示在MEL细胞诱导前后，细胞内不同铁状态时铁螯合酶mRNA的表达水平：加入转铁蛋白, 增加未诱导MEL细胞表达铁螯合酶mRNA，但对经诱导的MEL细胞作用较微弱；加入去铁胺,对经诱导和未经诱导的MEL细胞均产生轻度抑制作用。

图4不同铁状态下MEL细胞在DMSO诱导前后铁螯合酶mRNA比较

5Epo对TfR mRNA表达水平的影响图5示在MEL细胞诱导前后，Epo对TfR mRNA表达水平的作用。在未经诱导的MEL细胞中，Epo对TfR mRNA的表达水平几乎无任何作用；在经