关键词： 白血病；细胞系；细胞凋亡；基因，p53；紫外线

摘要目的：观察野生型p53基因转染的K562细胞对紫外线诱导其细胞凋亡的影响。方法：应用基因转染技术将重组野生型p53的逆转录病毒载体转导P53蛋白缺失的K562细胞，用紫外线照射K562-p53细胞不同时间后再培养不同时间，用DNA片段化和细胞DNA原位末端标记技术检测细胞凋亡情况。结果：紫外线照射K562-neo和K562-p53细胞8分钟后再培养7～12小时，K562-neo和K562-p53两组细胞的凋亡差异显著。结论：野生型P53蛋白在K562细胞表达后，能加速紫外线诱导的K562细胞凋亡，为临床应用p53进行基因治疗提供了有意义的实验基础。

Enhancement of apoptotic sensitivity induced by UV irradiation on the p53-transducted K562 cellsChen Dexi, Wang Shenwu, Cao Guodong,et al. Central Laboratory, People's Hospital, Beijing Medical University，Beijing100044

AbstractObjective:To answer whether wild-type p53 can sensitize K562 cell apoptosis induced by UV irradiation.Methods: K562 cells transducted with retrovirus encoding wild-type p53 were irradiated by ultraviolet for different time and then cultured for different time. Apoptosis was detected by TDT end labelling technique, DNA fragmentation and MTT assay.Results: TDT end labelling and DNA fragmentation showed that apoptosis induced by 8 min UV-irradiation differed significantly between K562-neo and K562-p53 cells.Conclusion: Wild-type p53 can enhance apoptosis induced by UV-irradiation on K562 cells

Key wordsLeukemiaCell lineApoptosisGene,p53Ultraviolet

p53基因是一种重要的抗癌基因，日益受到人们的重视。近年来研究表明，p53基因与细胞生长停滞和凋亡有密切的关系。向缺乏正常p53活性的细胞株导入野生型p53基因，可使P53蛋白介导的许多功能得以再现，如生长停滞和细胞分化及对细胞凋亡的诱导作用^［1］。为了研究p53对白血病细胞K562增殖和凋亡的影响，我们把重组有编码人野生型p53的逆转录病毒感染K562细胞，观察它们的增殖和凋亡变化,并用紫外线照射，观察p53对紫外线所致K562细胞凋亡的影响。旨在为p53基因临床治疗应用的可行性提供理论和实验依据。

材料和方法

1细胞培养K562细胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基(Gibco BRL)中，在5% CO₂条件下培养。

2pLXSN-p53逆转录病毒载体的构建pC53-SN3由本室保存，含人野生型p53 cDNA，全长1.8kb，BamHⅠ切点。用BamHⅠ酶切后回收p53 cDNA片段，装入经BamHⅠ酶切的逆转录病毒载体pLXSN中。用PCR鉴定p53 cDNA正向插入的重组体，命名为pLXSN-p53。病毒转导K562细胞及转导p53后K562细胞的p53表达变化见文献［2］。

3末端转移标记检测DNA^［3］取细胞1×10⁵涂片后用甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定15分钟。用PBS洗2遍后加50μl转移标记液(TDT 5U，5×缓冲液 10μl，Biotin-11-dUTP 1μg，H₂O 38μl)，放入湿盒37℃1小时。用反应终止液洗1遍，加1∶1 000稀释的SA-AP 100μl，放入湿盒37℃ 30分钟。用PBS洗2遍后，取显色缓冲液1ml加4.4μlNBT，3.3μlBCIP，每片加100μl，室温暗处显色，根据显色深浅终止反应，脱水后观测结果并照相。

4DNA凋亡片段分析^［4］取K562-neo及K562-p53各5×10⁶,37℃培养4小时后去上盖，在超净台内距40W紫外灯管75cm处用紫外灯照射8，10，12分钟后再继续培养8小时。取待分析细胞(每管5×10⁶)加入裂解缓冲液100μl(1% NP40，20mmol/L EDTA， pH=8.0，50mmol/L Tris-HCl， pH=7.5)，振荡10秒钟后离心回收上清。上清加RNA酶10μl (10μg/μl) 和10% SDS 10μl，56℃ 2小时,加入蛋白酶K 至终浓度5μg/μl，37℃3小时。加入10mol/L醋酸胺50μl，混匀后加入400μl乙醇，离心沉淀后进行1%琼脂糖凝胶电泳。

5氮蓝四唑盐(MTT)实验^［5］96孔培养板中接种K562-neo和K562-p53细胞液，每孔100μl(10⁸/L)，另加一个无细胞的空白管，37℃培养4小时后去上盖，在超净台内距紫外灯管75cm处用紫外灯照射8分钟,再继续培养3,5,7,9,11,13,15小时后每孔加入MTT 20μl(5mg/ml)，继续培养4小时后加入10% SDS 100μl， 6小时后在波长570nm处测A(吸光度，曾称光密度OD)值。

结 果

1K562-p53对紫外线所致细胞凋亡敏感性 紫外线照射K562-neo和K562-p53细胞8，10，12分钟后再继续培养8小时检测DNA梯形片段，未照射细胞无凋亡片段产生。K562-neo和K562-p53细胞均出现梯形片段，10小时凋亡片段似乎达到饱和。随照射时间的增加，梯形片段也增加。

TDT末端标记结果见图1：紫外线照射8分钟后再培养2小时，进行末端标记，发现K562-neo尚未检测到凋亡，而K562-p53则有明显的凋亡染色颗粒，呈块状分布。扫描K562-neo细胞和K562-p53细胞的吸光度分别为0.12±0.02及0.43±0.05，经t检验两者差异显著(P＜0.01)。

2紫外线照射K562-p53细胞存活率测定 紫外线照射K562-neo和K562-p53细胞8分钟后，在培养不同时间进行MTT实验，结果见图2。紫外线照射后，随着时间增加，存活细胞数减少，K562-p53细胞比K562-neo细胞的存活细胞数减少更为明显。说明转导野生型p53产生的p53蛋白增加了K562细胞对紫外线照射所致凋亡的敏感性，使存活细胞数减少，死亡细胞增加。

图1紫外线照射K562-p53细胞8分钟后再培养

2小时的DNA缺口末端标记(×400)

图2紫外线照射K562-neo和K562-p53细胞8分钟后再培养

0,3,4,5,6,7,8,9小时后的MTT检测结果

讨 论

目前对p53基因在癌变过程中的作用研究较为深入，实验研究证明p53基因失活或缺失可促使多种肿瘤的发生，并可使细胞出现耐药性和降低放疗敏感性。P53蛋白具有潜在的抗细胞增殖作用，可使细胞停滞于G₁期^［6］。自1991年Yonish-Rouach等发现野生型p53基因的表达可诱发急性髓细胞白血病(M₁)细胞发生凋亡后，又有许多实验研究都证明p53基因在细胞凋亡过程中起着重要的作用。

化疗药物和放疗被广泛用于癌症治疗，并认为是通过p53依赖性途径而诱导细胞凋亡来实现肿瘤的杀伤^［7］。当细胞对环境刺激(包括化疗和放疗)所致的损伤作出反应时，可诱导野生型p53蛋白表达水平迅速增高，从而使细胞进入G₁期生长抑制而有利于细胞修复损伤或在损伤严重不能修复时诱导细胞进入凋亡状态^［8］。

我们为研究p53的作用机制，把野生型p53通过逆转录病毒表达载体pLXSN-p53感染K562细胞。K562细胞为p53RNA第135密码子插入突变,并使其后的整个阅读框发生改变,在147位出现终止信号,因此,K562细胞中无正常结构的P53蛋白而使p53的功能完全丧失。当野生型p53逆转录病毒感染K562细胞后3天，可见一些细胞形态发生变化，核浓缩、胞膜皱缩、凋亡小体形成，提取染色体DNA电泳，可见弱的凋亡DNA “梯形”,细胞生长速度明显变慢，出现G₁期生长抑制现象。可见野生型p53导入K562细胞后，可诱导细胞产生G₁期抑制和凋亡。

有研究认为，p53蛋白、一些化疗药物和紫外线、γ射线等诱导的细胞凋亡，只有细胞进入G₁期才能起作用，如果细胞在S期和G₂/M期，它们将不能诱导细胞进入凋亡，只有细胞进入到下一个细胞周期的G₁期，它们才能起作用。我们的研究显示野生型p53具有使K562细胞停滞于G₁期的作用，因此从理论上讲使G₁期细胞数量增多，将有利于基因损伤药物对K562细胞的杀伤作用。

综合上述结果与分析，我们证实p53可诱导K562细胞进入G₁期生长抑制和诱导细胞进入凋亡状态。该研究结果对于我们临床应用野生型p53进行基因治疗提供了有意义的实验基础。

本课题受国家自然科学基金 (394703160)资助

参 考 文 献

1Vogelstein B, Kinzler KW. P53 functionand dysfunction. Cell, 1992,70:523-526.

2王申五.髓性白血病细胞P53基因表达下调.中华肿瘤杂志, 1996,18:102-104.

3Yael G,Yoav S. Identification of programmed cell death in situ via specific labelling of nuclear DNA fragments. J Cell Biol, 1992,119:493-501.

4Herrmanm