关键词： 抗药性，多药；逆转录病毒；基因,mdr1；基因表达

摘要目的：观察内在核糖体进入位点(IRES)控制多药耐药基因mdr1的表达能力。方法：以帽依赖性Ha mdr1载体为对照，利用pSXLC/pHa系统构建依赖脑心肌炎病毒IRES翻译的逆转录病毒载体Ha-IRES-mdr1(HaI mdr1)，脂质体转染法导入鼠源包装细胞GP+E86并获得长春新碱耐药细胞；用聚合酶链反应(PCR)与流式细胞术(FCM)检测mdr1基因的转移与表达。结果：病毒生产细胞GP+E86/HaI mdr1上清中逆转录病毒的滴度为2.0×10⁵cfu/ml，对长春新碱、柔红霉素与紫杉醇产生交叉耐药(24～52倍)，而且具有多药耐药表型。PCR证实mdr1基因已稳定整合至GP+E86/HaI mdr1细胞基因组；FCM分析表明IRES能引导mdr1基因翻译成P-糖蛋白而高效表达，程度略低于Ha mdr1对照。结论：IRES可引导mdr1基因进行有效的帽非依赖性翻译，mdr1基因在双顺反子载体中可作为显性选择性基因用于基因治疗。

Efficient expression of multidrug resistance gene mdr1 in retroviral vector under control of an internal ribosome entry siteFu Jianxin, Chen Zixing, Wang Wei, et al. Jiangsu Institute of Hematology, First Affiliated Hospital of Suzhou Medical College ,Suzhou 215006

AbstractObjective: To test the efficiency of human mdr1 gene expression under the control of an internal ribosome entry site (IRES).Methods: The expression retroviral vector HaImdr1 was constructed from pSXLC/pHa system which contains an IRES from encephalomyocarditis virus. The vector was introduced into ecotropic packaging cells GP+E86 by liposome-mediated transfection. The retrovirus producing cells were obtained by 50μg/L vincristine selection. The success of transfer and expression of mdr1 gene were determined by polymerase chain reaction (PCR) and flow cytometry (FCM).Results: Virus in the supernatant of the producer cells, in which the integration of mdr1 gene was confirmed by PCR, was titrated to 2.0×10⁵ cfu/ml. The selected producer cells exhibited a 24～52-fold increase of resistance to vincristine, daunorubicin and taxol in comparison with control cells GP+E86. The expression of mdr1 gene was confirmed by both reverse transcription PCR at RNA level and FCM at protein level, although the HaImdr1 transfectants showed somewhat less expression of P-gp when compared to that with cap-dependent translation of Ha mdr1.Conclusion:mdr1 gene can be effectively translated and expressed under the control of IRES in cap-independent manner , it may be used as a dominant selectable marker in bicistronic vectors for gene therapy.

Key wordsDrug resistance,multipleRetrovirusGene,mdr1 Gene expression

基因转移为恶性肿瘤与遗传病的治疗提供了一种新策略，其中逆转录病毒介导的基因转导已为多数临床试验方案采用。为提高外源性基因的表达水平和持续时间，使用体内选择性标志对转导细胞进行选择以及采用细小RNA病毒内在核糖体进入位点(IRES)构建双顺反子载体是近年来的重要策略^［1,2］。我们构建了含脑心肌炎病毒(EMCV)IRES引导mdr1基因的逆转录病毒表达载体并在鼠源包装细胞中获得高效表达，为进一步以造血干细胞（HSC）为靶子进行基因转移奠定基础。

材料和方法

1主要试剂限制性内切酶、T₄ DNA连接酶、Wizard^TM微量DNA纯化系统均购自SABC；DOSPER脂质体转染试剂与琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒为Boehringer Mannheim产品；高糖DMEM培养液、总RNA提取试剂TRIzol与M-MLV逆转录酶均为Gibco/BRL产品；聚凝胺、长春新碱(VCR)、紫杉醇(Taxol)与MTT为Sigma产品；柔红霉素（DNR）由意大利Farmitalia公司提供；藻红蛋白(PE)标记的P-糖蛋白(P-gp)单抗UIC2及同型对照购自法国Immunotech公司；无RNase的DNase Ⅰ(Worthington公司)与PCR试剂(Sangon公司)由上海生工公司提供；其余试剂为国产分析纯。

2质粒与细胞系大肠杆菌DH_5α为本室保存；质粒pSXLC-mdr1、逆转录病毒载体pHa mdr1^［3］均由美国NCI Pastan教授馈赠。鼠源单向型包装细胞GP+E86由美国哥伦比亚大学Bank教授提供，NIH3T3细胞由本实验室保存，均以DMEM(含15%小牛血清)在37℃、5%CO₂中饱和湿度培养。

3表达载体的构建将pSXLC-mdr1和pHa mdr1均以SacⅡ与XhoⅠ酶切，分别电泳回收4.6kb的IRES-mdr1片段和11.0kb的pHa空载体，将两者连接并转化大肠杆菌，以SacⅡ与XhoⅠ酶切与PCR方法鉴定阳性重组子。

4DNA转染病毒包装细胞及其病毒滴度检测参照供应商推荐的方法，用DOSPER脂质体转染试剂将纯化的质粒DNA导入包装细胞GP+E86，48小时后将转染细胞稀释于100mm培养皿(Corning公司)并以50μg/L VCR筛选至耐药克隆出现；以NIH3T3细胞为受体细胞常规测定上清中病毒滴度; 辅助病毒检测采用3T3放大的标志基因补救法。同时用载体Ha mdr1为对照。

5PCR检测mdr1基因的整合与表达以病毒生产细胞的基因组DNA为模板，用PCR检测mdr1原病毒的整合；用TRIzol提取生产细胞总RNA，用DNase Ⅰ处理以去除可能污染的微量DNA，用随机引物逆转成cDNA，再用PCR方法检测mdr1基因的表达。PCR引物为H mdr1(5′-GCCTG GCAGC TGGAA GACAA ATACA CAAAA TT-3′)与H mdr2(5′-CAGAC AGCAG CTGAC AGTCC AAGAA CAGGA CT-3′)；热循环仪为Gene Amp System 9600（Perkin Elmer公司）。PCR反应参数：95℃30秒，63℃45秒，共30个循环；扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析并照相。

6体外药物敏感试验按本室常规方法进行IC₅₀测定。2×10³待测细胞铺于96孔平底培养板(NUNC产品)，加入不同浓度的细胞毒药物(VCR、DNR和Taxol)，培养5天后用MTT法测定活细胞数并计算IC₅₀值。

7流式细胞术（FCM）检测P-gp表达按本室建立的直接免疫荧光法进行。简述为：胰酶消化的10⁶细胞用PBS洗涤，加入1μg PE标记的UIC2单抗或同型单抗对照，于4℃孵育30分钟， PBS洗涤后用流式细胞仪(Coulter公司Epics XL型)分析约10?000个细胞的平均荧光强度(MFI)与阳性率，激发波长为488nm，功率为260mW，于585/40 nm通道检测红色荧光。

结果

1表达载体pHa-IRES-mdr1质粒pSXLC-mdr1经双酶切后获得约4.6kb的IRES-mdr1片段，将其与同样酶切的pHa空载体连接并转化DH_5α而构建成pHa-IRES-mdr1(HaI mdr1，见图1)。表达载体以SacⅡ/XhoⅠ酶切，可得到4.6kb片段，表明含IRES的mdr1 cDNA已被克隆入表达载体，并经PCR证实。

其中LTR为Harvey小鼠肉瘤病毒LTR；

MCS为多克隆位点；IRES源自EMCV

图1逆转录病毒表达载体HaI mdr1结构示意图

2重组病毒生产细胞经DOSPER介导将质粒导入包装细胞GP+E86，VCR筛选得到抗性细胞，命名为GP+E86/HaI mdr1；以NIH3T3细胞为受体细胞，测得其上清中病毒滴度为2.0×10⁵cfu/ml，表明该载体可被包装成病毒颗粒；该病毒不能与NIH3T3/Neo^R细胞所含有的病毒顺式结构发生反式互补而再形成病毒颗粒，即无辅助病毒的产生，表明基因转移系统的安全性。对照载体Ha mdr1转染的GP+E86/Ha mdr1细胞可产生6.2×10⁵cfu/ml的鼠源逆转录病毒，与GP+E86/HaI mdr1生产细胞相近。

3mdr1基因的整合与转录以GP+E86/HaI mdr1细胞基因组DNA为模板进行PCR，可出现与质粒阳性对照相同的产物(283bp)，表明mdr1原病毒已整合入宿主基因组（图2）；RT-PCR结果表明GP+E86/HaI mdr1细胞有明显的mdr1 mRNA表达，而对照则无表达。

M：分子量标准(pUC19 DNA/MspⅠ, MBⅠ)；1：GP+E86细胞；2：GP+E86/HaI mdr1细胞； 3：质粒阳性对照；4：阴性对照

图2PCR分析mdr1基因的整合

4GP+E86/HaI mdr1细胞的耐药特性如附表所见，GP+E86/HaI mdr1细胞与对照细胞相比，前者对VCR、DNR和Taxol的IC₅₀值比后者提高24～52倍；GP+E86/Ha mdr1细胞对上述3种药物较母株耐药30～198倍，其值略高于GP+E86/HaI mdr1细胞。同时证实转染mdr1基因可导致受者细胞获得多药耐药表型。

5IRES控制P-gp的表达以FCM检测转化子P-gp的表达来分析IRES引导mdr1基因的翻译能力，结果如图3所示：用UIC2单抗证实GP+E86/HaI mdr1细胞高表达P-gp，MFI与表达率分别达26.2与97.9%，而未转染的GP+E86细胞则分别为2.95与1.1%。表