目前国外检测端粒酶活性的端粒重复序列扩增方法(TRAP)多采用放射性同位素标记引物或底物，经PCR扩增后行放射自显影，不仅费时，而且存在放射性同位素标记和放射性废物处理的问题。我们用K562细胞和人工合成的引物，经PCR扩增后用特殊的荧光染料SYBR green I染色，利用凝胶成像分析仪进行了TRAP产物定量分析，探讨本法对端粒酶活性检测的特异性、敏感性和最佳反应条件。

材料和方法

1K562白血病细胞株本校免疫教研室惠赠。

2引物端粒酶底物引物(Telomerase Substrate, TS):5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′;下游CX引物：5′-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3′(美国赛百盛公司合成)。

3主要试剂 N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)、4-(2-氨乙基）苯磺酰氟( aEBSF) 、3-［(3-胆酰胺丙基)-二乙铵］-丙磺酸(CHAPS)、T₄基因32蛋白和Taq酶购自Boehringer mannheim公司。SYBR Green Ⅰ购自FMC 公司。pBR322/HaeⅢ和dNTPs购自华美公司。

4K562细胞的培养、裂解和端粒酶液的制备K562细胞于RPMI1640培养液中(加10%小牛血清，37℃、5%CO₂)培养。收集K562细胞后离心5分钟(1?000×g),沉淀用PBS洗涤两次。调整细胞为3.5×10⁶,台盼蓝染色示活细胞大于95%。将K562细胞重悬于预冷的清洗缓冲液中(10mmol/L hEPES,pH7.5;1.5 mmol/L MgCl₂,10 mmol/L KCl,1 mmol/L二硫苏糖醇),离心2分钟(4℃,1?000×g)。再将细胞重悬于200μl预冷的裂解缓冲液中(10mmol/L tris-HCl, pH 7.5；1mmol/L MgCl₂ ,1mmol/L 乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA),0.1mmol/L AEBSF，5mmol/L β-巯基乙醇，0.5% CHAPS, 10%甘油)。充分混匀后,置冰上孵育30分钟,然后于4℃离心30分钟(16?000×g)。迅速取出上清,于液氮中快速冻存。部分细胞提取液采用Folin-酚试剂法测定蛋白水平,总蛋白浓度为3.5mg/ml。

5TRAP反应

5.1标准反应条件：聚合酶链反应(PCR)总体积50μl,包括20mmol/L tris-HCl, pH8.3；1.5mmol/L MgCl₂, 63mmol/L KCl, 1mmol/L EGTA, 0.05%吐温-20, 0.01%牛血清白蛋白, 1μg T₄基因32蛋白,Taq酶2U,100μmol/L dNTPs, 0.1μg TS引物、0.1μg CX引物和2μl K562细胞提取液。充分混匀并短暂离心后,于23℃孵育30分钟, 然后于90℃首先作用90秒, 最后开始35次PCR循环。循环条件为94℃30秒;50℃30秒; 72℃45秒,最后保温3分钟后终止反应。

5.2TRAP的特异性：在标准条件下以及分别未加引物、底物、Taq酶和细胞提取液,并对细胞提取液完成各种预处理措施后,进行TRAP反应。预处理措施包括：①RNase a 预处理：每微升细胞提取液中加入 RNase A 0.1μg, 于37℃孵育1小时；②加热预处理：85℃加热10分钟；③蛋白酶K预处理：每μl细胞提取液中加入蛋白酶K 0.3μg, 于37℃孵育30分钟。

5.3TRAP的敏感性：将K562细胞提取液分别10，100，1?000倍稀释后,各取2μl于标准反应体系中。

5.4TRAP的最适反应条件：①标准反应条件下, PCR总循环次数分别为10，20，25，30和35次；②标准反应条件下,底物浓度分别为50，100和150 μmol/L；③标准反应条件下,端粒酶介导的TS链延长反应的孵育时间分别为5，10，20和30分钟。

6非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳TRAP扩增产物于12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,恒压10～15V/cm, DNA分子量标准为pBR322/HaeⅢ。

7凝胶的染色SYBR GreenⅠ 染色: SYBR Green Ⅰ浓缩液用1×TBE稀释10?000倍后染色30分钟。同时采用溴化已锭和银染色^［1］作对比。

8凝胶的成像分析利用UVP公司的凝胶成像分析仪GDS-8000,采用GRAB-IT和GEL wORKS软件对凝胶进行成像分析，先求出每一条带的峰面积(volume),得出每一泳道(lane)峰面积的总和,并扣除阴性对照的背景值,即为每一标本的端粒酶活性。

结果

1TRAP的特异性在分别未加引物、底物、Taq酶和端粒酶液,并对酶液进行各种预处理措施后行TRAP反应,均无阳性结果。而K562细胞提取液及其10倍稀释液在标准条件均扩增出端粒酶特异性的相差6个核苷酸的DNA梯带。

2TRAP的敏感性K562细胞提取液分别10、100和 1?000倍稀释后行TRAP反应,其相对端粒酶活性分别为K562未稀释液的148%、35%和10%。

3TRAP的最适反应条件10个循环的TRAP产物不能被 SYBR Green I检出,而35个循环的产物量最多；底物浓度100μmol/L时TRAP产量最多；TS链延长反应的孵育时间从5分钟～30分钟均可扩增出端粒酶特异性的DNA条带,但30分钟条件下的产量最多,尤以小分子量的DNA产物为著(见附图)。

1和15：DNA分子量标准，为pBR322/HaeⅢ；2～6：10，20，25，30和35个PCR循环次数；7～9：50，100和150μmol/L的底物浓度；10～13：孵育时间为5，10，20和30分钟；14：阴性对照

附图TRAP方法的最适反应条件

4不同染色方法的比较EB染色无法检出TRAP扩增产物。银染方法的检测灵敏度低于SYBR green Ⅰ,而且背景较差。 SYBR Green I 染色后DNA产物具有条带显著、背景清晰的特点，并可检出低至20ng的pBR322/HaeⅢ,但以大分子量的DNA片段明显。

讨论

尽管TRAP方法目前被广泛用于端粒酶活性的检测，但仍存在许多有待改进和完善之处。TRAP方法本身无法对端粒酶活性作定量分析，一般仅能根据细胞提取液的蛋白含量或细胞数进行半定量分析，而且TRAP对端粒酶活性的检测尚处于细胞群而非单细胞水平。

本文特异性实验结果表明, TRAP扩增产物必须依赖于引物、底物、Taq酶和端粒酶液的共存，标准反应条件下, 端粒酶首先介导的TS引物的链延长产物作为PCR扩增的模板,扩增出的相差6个核苷酸的DNA产物，真实反映了端粒酶的活性。因此,TRAP方法是检测端粒酶活性的特异方法。

K562细胞提取液10倍稀释后的相对端粒酶活性为K562未稀释液的148%，可能是由于较高蛋白含量的细胞提取液中存在Taq酶抑制物，使TRAP扩增产量降低，甚至出现假阴性的结果。国外文献也有了相同报道^［2］。本文结果表明35个总循环次数是TRAP比较适宜的反应条件。

银染方法虽然也可检出端粒酶特异性的DNA条带，但由于细胞提取液和PCR缓冲液中均含有蛋白质，因此条带间的背景较差，无法对端粒酶活性作半定量分析和比较。

SYBR GreenⅠ 是一种对双链DNA有高度亲和力的荧光染料。在300nm波长的紫外光透射下，其检测低限可达60pg的双链DNA, 其敏感性较 EB高25～100倍，尤其适用于低拷贝基因的PCR扩增产物的检测。较之同位素标记和放射自显影方法，方便安全。SYBR green I对TRAP扩增产物的检测具有条带显著、背景清晰的优点，是一种简便快速的染色方法。

TRAP方法对端粒酶活性的检测，要求制备端粒酶液的细胞或组织标本中含有生物活性的端粒酶，更由于端粒酶本身特殊的化学组成和对RNA酶的高度敏感性，因此，在整个TRAP操作过程中应严格避免端粒酶被RNA酶降解，以防出现假阴性结果。而我们建立的TRAP方法具有快速、简便、特异性强、敏感性高等优点，同时无放射性同位素标记及相应的放射自显影,适用于临床检测端粒酶的活性。

本课题受国家自然科学基金（3967076)资助

参 考 文 献

1Bassam BJ, Caetano-Anolles G，Gressoff PM. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Anal Biochem，1991,196:80-83.

2Wright WE, Shay JW， Piatyszek MA. Modification of a telomeric amplification protocol.(TRAP) result in increased reliability,linearity and sensitivity. Nucl Acid Res，1995,23:3794-3795.

(收稿：1997-12-08修回：1998-06-19)

(校对：张吉贤)