多发性骨髓瘤(MM)是B淋巴细胞的恶性肿瘤。氧化砷(As₂O₃)已成功地用于急性早幼粒细胞白血病的治疗，其机制是诱导白血病细胞凋亡。我们初步研究了As₂O₃对MM细胞株(KM₃)的作用及其机制，旨在为MM的治疗提供借鉴。

材料和方法

1试剂As₂O₃(分析纯)溶于生理盐水，制成10^-3mol/L贮存液。工作浓度为0.5～6.0μmol/L。

2细胞培养KM₃细胞由本室长期传代。以2×10⁵/ml细胞浓度接种于含10%灭活FCS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的新鲜RPMI 1640培养液中培养(37℃，5％CO₂), 每24小时用台盼蓝拒染法计数活细胞数，并加入新鲜培养液调节细胞浓度不超过4×10⁵/ml。

细胞存活力（％）＝活细胞数/总细胞数×100%

3乳酸脱氢酶(LDH)活性检测As₂O₃与KM₃共同培养24, 48小时后, 收集上清检测LDH活性, 以此反映细胞毒作用。0.2%Triton-100溶解KM₃细胞后, 收集上清作阳性对照。

4细胞形态学细胞与一定浓度As₂O₃共同培养不同时间后，于倒置显微镜下或制成细胞涂片，经Wright染色后观察。

5流式细胞仪检测细胞周期于不同时间收集与不同浓度As₂O₃共培养的细胞，经PBS洗2遍，加入无水乙醇, 4℃固定24小时以上，与含1％RNA酶的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)37℃孵育30分钟，用碘化丙锭进行DNA染色，上机检测(Epics XL, Coulter)。资料经Apoptosis软件(AP000099.PRO)分析处理。

6基因组DNA电泳参见文献［1］方法。

结果

1As₂O₃抑制KM₃细胞生长图1a,b显示不同浓度As₂O₃对KM₃细胞生长的抑制作用，这种作用呈时间、剂量依赖性。其中经1.0和2.0μmol/L As₂O₃处理4天，KM₃细胞活力分别减少到60％和35％，而0.5μmol/L As₂O₃对KM₃细胞存活力影响不大，但能抑制其生长，第6天时活细胞数为16.11×10⁵/ml,而对照组活细胞达237.80×10⁵/ml。

2As₂O₃对KM₃细胞形态学影响经1.0μmol/L以上As₂O₃处理KM₃细胞后，随着时间推移，KM₃细胞显示凋亡细胞的特征性形态改变。

3培养上清LDH活性检测结果见图2。

4流式细胞仪分析KM₃细胞DNA含量显示，经不同浓度As₂O₃处理后的KM₃细胞，可见DNA含量低于G₁期的凋亡细胞群，这群细胞的比例随As₂O₃浓度的递增及作用时间的延长而增加(图3)。

5基因组DNA电泳1.0μmol/L以上的As₂O₃与KM₃细胞作用48小时后，DNA电泳显示梯状降解条带。

图1As_２O_３对KM_３细胞生长的影响

图2培养上清LDH含量

讨论

LDH是参与细胞呼吸过程的细胞内酶，检测培养上清的LDH活性可间接反映细胞膜完整性。KM₃细胞经2.0μmol/L砷剂作用48小时，培养上清LDH活性为10U/L，与对照组(4U/L)相差不大，表明此时细胞膜相对完整，而基因组DNA电泳仍见梯状DNA存在，提示DNA降解是由As₂O₃引起的细胞死亡前表现，而非继发于细胞坏死。

近年来发现， 有些肿瘤细胞增殖并未见异常， 而其程序性死亡则明显受抑，这种细胞凋亡异常可能在某些肿瘤发展中起重要作用。MM是一增殖较为缓慢的浆细胞肿瘤^［2］，其瘤细胞增殖指数并不高，大量研究表明，恶性浆细胞之所以能在体内大量积聚， 与其表达较高水平的bcl-2基因，从而阻止了骨髓瘤细胞的程序性死亡有关^［3］。另有研究表明^［4］，大多数骨髓瘤细胞表达FAS抗原，抗FAS单抗能诱导部分骨髓瘤细胞的程序性死亡。As₂O₃诱导KM₃细胞的凋亡是否涉及这些途径正在研究之中。

图3As_２O_３诱导KM_３细胞凋亡比例

参 考 文 献

1Prigent P, Blanpied C, Aten J, et al. A safe and rapid method for analyzing apoptosis induced fragmentation of DNA exteracted from tissues or cultured cell. J Immunol Methods, 1993, 160:139-140.

2Drewinko B, Alexanian K, Boyer H, et al. The growth fraction of human myeloma cells. Blood, 1981, 57: 333-338.

3Sangfelt O, Osterborg A, Grander D, et al. Response to interferon therapy in patients with multiple myeloma correlaties with expression of BCL-2 oncoprotein. Int J Cancer,1995,63：190-192.

4Shim Y, Nishimoto N, Ogata A, et al. Myeloma cells express FAS antigen/APO-1(CD₉₅) but only some are sensitive to anti-FAS antibody resulting in apoptosis. Blood, 1995, 85: 757-764.

(收稿：1997-10-05修回：1998-06-09)

(校对：王叶青)