人多发性骨髓瘤(MM)细胞系SKO-007是新近建株于MM患者的骨髓瘤细胞,它是否自泌白细胞介素6(IL-6)尚未见报道。

材料和方法

1细胞培养与样品收集将SKO-007细胞(ATCC购置)悬浮于含10%灭活小牛血清(FCS)的RPMI1640培养体系中,37℃、5%CO₂条件下培养2～3天换液传代1次。试验前,收集细胞用无血清的RPMI1640培养液洗涤两次,并饥饿4小时。再同法洗涤两次,收集末次洗涤液和1.5×10⁷细胞作为培养0小时之样品。将其余细胞转入10%FCS rPMI 1640培养液中(每瓶14ml,细胞1.5×10⁷个,共6瓶)继续37℃、5%CO₂培养,分别于第3,6,12,24,48和72小时收集全部培养上清和细胞样品。

2IL-6活性分析37℃解冻鼠杂交瘤细胞系7TD₁细胞(ATCC购置),立即转种于含5ng/ml rhIL-6(军事医学科学院三所三室提供,2.5×10⁷U/mg)和5×10^-5mol/L2-巯基乙醇的预温10%FCS RPMI 1640培养液中,37℃、5%CO₂条件下培养24小时后换液1次,扩大培养。收集7TD₁细胞,用无血清的RPMI1640培养液洗涤2次,并饥饿3～4小时,用10%FCS RPMI 1640培养液调细胞浓度为2×10⁴/ml,每孔70μl接种于96孔板。同时于每孔加入不同浓度的rhIL-630μl和SKO-007培养上清30μl,用培养液补足200μl,37℃、5%CO₂培养68小时,加入10μl5mg/ml MTT,继续培养4小时,吸弃上清,加入100μl二甲基亚砜溶解甲月赞,测波长为570nm处的吸光度(A,曾称光密度OD)值。

3ELISA法测IL-6浓度将收集的细胞培养上清液13ml浓缩至250μl备用。包被时已知浓度的rhIL-6每孔10μl,浓缩样品每孔30μl,用包被液补足100μl,4℃过夜。PBS-0.1%Tween20洗板3次,加1%BAS37℃封闭1.0～1.5小时,洗涤3次,加rhIL-6 McAb Cala［1∶（500～1?000）,本室制备］100μl,室温2小时,洗板3次,加入辣根过氧化物酶标记的二抗SAM(1∶1?500,本室制备)室温40分钟,洗板5次,加TMB显色液,数分钟后用2mol/L h₂SO₄终止反应,测A₄₅₀值。

4APAAP法定位分析IL-6操作按药盒(军事医学科学院邦定生物工程公司产品)说明书进行。

5原位杂交方法见文献［1,2］。

6新生mRNA检测技术分析IL-6表达

6.1细胞核的制备^［3］和新生转录:向5×10⁶核内加入100μl2×反应缓冲液和3?700kBq［α-³²?P］UTP,25℃水浴振摇60分钟。

6.2新生mRNA的提取:加入250μl 10mmol/L EDTA(pH 8.0)、0.5% SDS溶液，250μl0.1mol/L NaAc(pH 5.2)、10mmol/L EDTA(pH8.0)溶液和500μl水饱和酚,振荡混匀1分钟,4℃10?000r/min离心10分钟。转移上清入另一个1.5ml管,加80μl1mol/L Tris*Cl pH8.0、36μl 5mol/L NaCl和1ml冷无水乙醇, -20℃30分钟,4℃ 10?000r/min离心10分钟,弃上清,沉淀溶于200μl TE。同法再沉淀1次。

6.3RNA和cDNA杂交与检测:见文献［3］。

结果

1培养上清IL-6活性分析见附图。由附图可见，24～72小时培养上清能够促进7TD_１细胞生长，且在98小时活性最强。

附图rhIL-6和SKO-007培养上清对7TD₁细胞生长的作用

2ELISA定量测定培养上清中的IL-6在12～72小时培养上清中检出了低水平的IL-6,且以48小时的含量(41.45±5.58pg/ml)高。

3APAAP法定位分析SKO-007 IL-6表达镜检发现在该细胞的胞浆区富集着紫红色的IL-6颗粒,而阴性对照HL-60细胞无此颗粒。

4原位杂交定位分析SKO-007 IL-6 mRNA镜检发现该细胞胞浆区被染成紫红色,阴性对照Motl₄细胞为蓝绿色,说明SKO-007细胞胞浆区存在IL-6 mRNA。

5SKO-007 IL-6的表达规律饥饿状态的SKO-007细胞核内催化IL-6 mRNA合成的RNA聚合酶活性极低,转入10%FCS RPMI 1640后该酶活性迅速增加,并在6小时达峰值水平(21.89%),随后稍有下降,并维持在中等水平(10.00%～12.00%)。

讨论

MM是以异常单克隆免疫球蛋白大量产生为特征的恶性浆细胞病,骨髓瘤细胞的增殖与IL-6的关系可分为3种:①旁分泌,即瘤细胞对周围环境中的IL-6的增殖反应;②自分泌,即瘤细胞对自泌IL-6的增殖反应;③因子非依赖性,即瘤细胞增殖与IL-6无关。弄清SKO-007的增殖类型、研究其增殖机制及寻求药物治疗,必须首先确定SKO-007是否自泌IL-6。我们从蛋白质和基因水平证实SKO-007细胞能够自泌IL-6,为下一步研究自泌IL-6对SKO-007增殖的效应奠定了基础。

本课题受军事医学科学院基础医学研究所分子免疫全军重点实验室资助,并在该室完成

参 考 文 献

1Foster AC,McLnnes JL,Skingle DC,et al.Non-radioactive hybridization probes prepared by the chemical labelling of DNA and RNA with a novel reagent,photobiotin.Nucl Acid Res,1985,13:745-752.

2McQuaid S,Allan GM.Detection protocols for biotinylated probes:optimization using multistep techniques.J Histochem Cytochem,1992,40:569-574.

3Honami N,Ian GY.Mechanisms regulating the mRNA levels of interleukin-5 and two other coordinately expressed lymphokines in murine T lymphoma EL 4.23.Blood,1994,83:3620-3628.

(收稿:1998-03-02修回:1998-06-03)

(校对:仵乾玉)