地中海贫血(地贫)是我国华南和西南地区的常见遗传病。尤其是β地贫无论对社会和个人、家庭都带来不可估量的危害。目前,检出β地贫携带者的基因型,进行产前基因诊断,是防止重型β地贫患儿的出生,预防本病的唯一有效方法。目前使用的寡核苷酸(ASO)杂交法和反向点杂交(Reverse dot blot method, RDB)法都有较为繁琐、费用昂贵,以致基层不易推广的缺点。Newton(1989)建立的突变扩增系统(amplification refractory mutation system, ARMS)是一种较好检测已知突变的方法,在地贫和其他一些疾病的检测中得到广泛应用^［1］。我国毛跃华等^［2］针对我国β地贫突变特点建立了检测4种突变的多重ARMS法，但对占我国β地贫突变第2位的C654-2T的检测未作报道。现报道我们建立的β地贫C654-2T突变的ARMS检测法,使检测我国β地贫主要突变类型的方法更加完善。

病例和方法

1原理在PCR反应中，如果引物的3′端不能与模板碱基配对,则用耐热DNA聚合酶无法延伸,从而可以通过引物设计,将有某种点突变的模板与正常分开。

2研究对象外周血标本,用常规法提取DNA, 经我室及第一军医大学用RDB法确定其基因型的14例β地贫标本作为检测对象。其中654-2/N 6例、41-42/N 2例、-28/N 2例、17/N 2例、71-72/N 2例,正常人2名作为对照。

3研究方法

3.1引物设计:

上游正常引物(654N):

5′ GAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTAAGGC 3′

上游突变引物(654M5):

5′ GAATAACAGTGATAATTTCTGGGTTATGGT 3′

下游共同引物(654C):

5′ GAGTCAAGGCTGAGAGATGCAGGA 3′

内对照引物:

上游5′ TTGTCGGTCTCCTGCTGGTCAGTG 3′

下游5′ CAAAGCCCTCACTCAAACATGAAGC 3′

3.2PCR反应条件:反应体积25μl,含基因组DNA 0.5～1.0μg, 10×缓冲液2.5μl, dNTPs(2mmol/L) 2.5μl,引物654C和654M5(或654N)各20ng,内对照引物各15ng,Taq酶2U(加拿大GENDA公司)。PCR仪为美国Ericomp公司产品。94℃变性5分钟后进入循环，94℃45秒、62℃1分钟、72℃1分30秒，进行25个循环后延伸72℃10分钟。

3.3结果观察:1.5%琼脂糖凝胶加微量溴乙锭,电泳10V/cm,15～20分钟,在紫外灯下观察结果。

结果和讨论

β地贫654-2突变标本在817bp处可见到一条扩增带和268bp的内对照带(附图)。内对照引物为dystrophin基因44外显子引物。由于其扩增结果非常稳定，因而选用。内对照带可反映DNA的质和量。由RDB法鉴定的6例654-2突变用此法均可见到此两条带，而2名正常、2例41-42/N、2例-28/N、2例17/N、2例71-72/N均仅有268bp的内对照带，而无817bp条带。说明此法具有较高的特异性。

a:用正常和突变ARMS引物扩增正常和654-2突变杂合子的结果

M为100bp ladder;1为654C-654N扩增正常DNA;2为654C-654M5 扩增正常DNA; 3为654C-654N扩增654-2突变杂合子DNA;4为654C-654M5扩增654-2突变杂合子DNA

b:用654C-654M5扩增654-2突变和其它突变的电泳结果

M为100bp ladder;1,6,7,9,10为654-2突变；2为正常DNA;3为41-42突变;4为-28突变;5为17突变;8为71-72突变

附图β地贫654-2突变及对照标本ARMS法检测结果

654-2突变的杂合子,由于2条11号染色体中有1条正常,所以用654C-654N和654C-654M5这两对引物扩增时都可在相应位置出现817bp扩增带；而正常DNA只有用654C-654N扩增时有带，654C-865M5扩增时无带(附图)。但是如果已知检测对象为杂合子,如重型β地贫患儿的父母或从正常孕妇夫妇筛查查出的β地贫携带者,则可只使用654C和654M5进行扩增,如果出现817bp带,则可定为654-2突变杂合子。如果检测绒毛或羊水细胞进行产前基因诊断,则须将654C-654N和654C-654M5同时扩增,两者均有817bp带为654-2的杂合子;654C-654N无带而654C-654M5有带,则为654-2突变纯合子或654-2突变与其它突变的双重杂合子;如仅654C-654N扩增有带,则表明无654-2突变存在。在作产前基因诊断时,结果判断宜慎重,必须与父母或先证者的基因型对照验证，必要时还可用RDB法验证。

ARMS又称等位基因特异性扩增法(allele specific amplification, ASA)是一种用来检测已知点突变的方法，用于多种疾病点突变的检测。国外曾根据地区特点设计了β地贫多种点突变的ARMS法检测^［3～5］，我国毛跃华等^［2］建立了我国4种突变的多重PCR法。根据广东、广西、四川、贵州、湖北、香港、台湾等地综合分析,我国常见的突变为:41-42(-4bp)(简称41-42)占41.6%,IVS-2 654(C654-2T,简称654-2),占21.8%,A17T(简称17)占18.0%,A-28G(简称-28)占8.0%,71-72(+A)(简称71-72)占3.9%,其它突变占6.7%。以上5种突变占我国β珠蛋白基因突变的93.3%^［6］,除毛跃华等检测的4种突变外,建立检测654-2的ARMS法不可缺少。我们曾经设计了4种检测此突变的下游引物,但都未能得到理想效果，估计是由于突变点的下游富含AT对碱基。后来我们参照Varawalla等的方法^［4］,将含突变的下游引物改为上游引物,获得了较为理想的结果。654-2突变ARMS检测法的建立,完善了我国常见5种突变的检测。

多重PCR的成功需要许多条件,诸如引物设计、各对引物的比例、反应条件，特别是各引物的3′端要避免互补等。如果在基层推广,还有一个对结果的准确判断问题，例如-28突变引物很接近引物二聚体,41-42和71-72突变的PCR产物仅相差约100bp,进行判断需要经验。因此,我们现在用ARMS法进行的常规β地贫基因诊断的程序是,首先同时分别进行41-42突变和654-2突变检测(可检出60%以上携带者的基因型),再作其它3种突变检测。

由于3′端单个碱基的错配并非在延伸时绝对不能越过突变碱基,所以需要在离3′端2～3个碱基处设计另一错配碱基，以增加其特异性。即使如此还应该严格控制循环次数为25次。

RDB法的最大优点是一次可以检出10多种突变,所以在确认为β地贫的前提下,用ARMS法未能查出突变时,可以使用RDB法。但由于RDB法较繁琐，试剂较贵，故在基层推广时建议使用ARMS法。我们已经制成检测β地贫5种常见突变的试剂盒，方便基层推广使用。

参 考 文 献

1Newton CR,Graham A,Heptinstall LE,et al.Analysis of any point mutation in DNA.The amplification refractory mutation system(ARMS).Nucl Acid Res，1989,17:2503-2516.

2毛跃华,孙琼,李争,等.应用多重等位基因特异性PCR技术进行β地中海贫血的基因诊断.中华医学遗传学杂志,1995,12:209-211.

3Fortina P,Dotti G,Conant R,et al.Detection of the most common mutations causing β-thalassemia in Mediterraneans using a multiplex amplification refractory mutation system(MARMS).PCR Meth Appl,1992,2:163-166.

4Varawalla NY,Old JM,Sarkar R,et al.The spectrum of β-thalassemia mutations on the Indian subcontinent:the basis for prenatal diagnosis.Br J Haematol,1991,78:242-247.

5Old JM,Varawalla NY,Weatherall DJ.Rapid detection and prenatal diagnosis of β-thalassemia: studies in Indian and Cypriot population in the UK.Lancet,1990,336:834-837.

6周玉球.中国人β地中海贫血的分子基础及产前诊断.国外医学遗传学分册,1995,18:132-137.

(收稿:1998-03-23修回:1998-05-25)

(校对:张志方)