血红蛋白珠蛋白肽链分析是临床诊断血液系统疾病,特别是地中海贫血的重要手段。目前主要应用聚丙烯酰胺凝胶电泳法,该法可把珠蛋白肽链α、β、δ、^Gγ、^Aγ链分开,但耗时长(一般2～3天)、操作繁琐、定量精确度差。近年来,随着毛细管电泳的迅速发展,国外已有人用毛细管自由区带电泳分离珠蛋白肽链^［1～3］。但是,对患者血样制成珠蛋白肽链溶液进行毛细管电泳分析时分离效果却不佳,出现大量杂峰,各珠蛋白肽链未达到基线分离,且电泳基线不稳,影响结果分析,而且均要经过珠蛋白肽链提取步骤,因而操作繁琐、费时,而且均采用涂渍毛细管,所以成本高。最近，我们采用非涂渍毛细管，省去珠蛋白肽链提取步骤,直接将血红蛋白液上样进行毛细管电泳,利用电泳缓冲液组分拆链,成功地分离了血红蛋白各珠蛋白肽链。该方法简单、快速,适合于临床标本的快速分析。现报道如下。

材料和方法

1主要试剂与标本电泳缓冲液与样本缓冲液配制按文献［3］略加改动。电泳缓冲液组成为 100mmol/L NaH₂PO₄,7mol/L尿素,1% Triton X-100(美国Sigma公司产品),1%巯基乙醇,0.25%聚乙二醇-6000(用2mol/L HCl调pH至3.2);样品缓冲液为10mmol/L NaH₂PO₄,7mol/L尿素,0.1%Triton X-100,0.1%巯基乙醇(用2mol/L HCl调pH至3.2)。NaH₂PO₄溶液与尿素混匀后须先加入AG501-x8树脂(美国Bio-RAD公司产品)搅拌过滤除去杂质,再加入其它成分,4℃保存备用;1.5%盐酸丙酮溶液(36% HCl 15ml加入985ml丙酮中,混匀),-20℃保存。正常新生儿新鲜脐带血肝素抗凝; 20份正常成人新鲜K₂EDTA抗凝血。标准血红蛋白A(Sigma公司产品)。其它化学试剂均为国产分析纯。

2血红蛋白液的制备取新鲜抗凝血200μl,用生理盐水3～4ml洗涤,离心5分钟(3?000r/min),反复洗3次。红细胞沉淀中加入1ml去离子水,剧烈振荡数分钟,然后再加入0.5ml四氯化碳充分混匀,离心10分钟(3?000r/min),上清液即血红蛋白液,此血红蛋白液血红蛋白浓度约20g/L(美国Cell-DYN1500血红细胞分析仪测定)。

3珠蛋白干粉的制备取上述血红蛋白液100μl逐滴加入约30分钟,离心10分钟(3?000r/min),沉淀用约1ml丙酮洗涤3次,最后沉淀物真空干燥30分钟,即得珠蛋白肽链粉。

4血样品准备a方法:用样品缓冲液溶解珠蛋白链粉剂;b方法:用超纯水稀释血红蛋白液至浓度为2g/L。

5毛细管电泳采用美国Bio-RAD公司生产的Bio Focus-3000自动毛细管电泳仪,自动和手动积分。毛细管为河北永年光导纤维厂生产的27cm×50μm非涂渍石英毛细管。新毛细管用前作如下处理:1mol/L NaOH冲洗10分钟,然后浸泡过夜,再用去离子水和电泳缓冲液冲洗。为了获得较好的重复性,每次电泳前均用0.1mol/L NaOH 及超纯水各冲2分钟,再用电泳缓冲液冲2分钟。压力进样6?894.76Pa/s(1p.s.i/s)，电压6kV,电流约20μA,温度控制在20℃,检测波长210nm。

结果

1按b方法进行处理的血红蛋白A,正常成人、新生儿血样毛细管电泳图谱见图1,2,3。血红蛋白A的平均α/β比值为1.01±0.02(n=10),正常成人β/α比值为1.05±0.06(n=20)。新生儿血液中^Gγ/^Aγ的比值为2.30,α/(β+^Gγ+^Aγ)的比值为0.99(n=50)。图4是用新生儿珠蛋白肽链粉按样品准备方法a制备后所得电泳图,杂峰多,难分辨其目标峰。

图1标准血红蛋白A电泳图(b方法)

图2正常成人血红蛋白电泳图(b方法)

图3新生儿血红蛋白电泳图(b方法)

图4新生儿血红蛋白电泳图(a方法)

2该方法重复性测定α、β链迁移时间的平均变异百分率为3.5%和4.8%,而且(β/α比值)日内和日间变异百分率分别为4.8%和5.1%,^Gγ/^Aγ比值日内和日间变异百分率分别为4.8%和6.2%。

讨论

血红蛋白A为两条α和两条β链组成的蛋白质分子α₂β₂;正常成人血中主要的血红蛋白成分为HbA, 其次为含量小于3.5%的HbA₂^［4］。正常新生儿血红蛋白中70%～80%为HbF(α₂γ₂),其次为HbA,而HbA₂(α₂δ₂)极少,甚至无。γ珠蛋白链有两种:^Gγ和^Aγ,在正常新生儿中^Gγ∶^Aγ≈7∶3,我们的结果与理论基本相符,正常成人β/α比值与Ong等^［1］报道的1.07±0.07相近。

直接用超纯水稀释血红蛋白进行电泳的效果比经过珠蛋白肽链提取然后电泳效果更好,而且各峰清晰(CA为碳酸酐酶峰,X峰尚不清楚)，达到基线分离。

用血红蛋白液直接进样，用缓冲液拆链达到较好的分离。这可能是缓冲液中尿素破坏血红蛋白中的共价键,β-巯基乙醇使二硫键破坏,这样血红蛋白三级结构破坏,Triton X-100使^Gγ、^Aγ分开^［5］,各珠蛋白链在高压电源作用下迅速得到有效分离。这样无须经过珠蛋白链的制备,简化了步骤,而且在40分钟内便可得到分离,同时采用非涂渍国产毛细管,大大降低了成本。这一方法的建立为临床血红蛋白病的诊断提供了一种简便、快速的手段。

参 考 文 献

1Ong CN,Lian LS,Ong HY.Separation of globins using free zone capillary electrophoresis.J Chromatography,1992,576:346-350.

2Ferranti P,Malorni A,Pucci P,et al.Capillary zone electrophoresis and mass spectrometry for the characterization of genetic variants of human hemoglobin.Anal Biochem,1991,194:1-8.

3Zhu MD,Rodriguez R,Wehr T,et al.Capillary electrophoresis of hemoglobins and globin chains.J Chromatography,1992,608:225-237.

4王继贵,主编.临床生化检验.第1版.长沙:湖南科学出版社,1996.286-311.

5刘永明,南国华.Triton X-100 酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳改良法和应用.江西医学院学报,1987,27:14-17.

(收稿:1998-02-16修回:1998-06-03)

(校对:徐丽娟)