关键词： 抗原，HLA-A；血清学；抗体，单克隆；DNA分型；移植

摘要目的：双盲比较研究血清学方法、单克隆抗体(单抗)方法和DNA方法用于中国汉族人群HLA-A抗原分型的精确性。方法：研究样本296份，包括143名无关供者和153例等待肾移植受者。血清学方法为二步法微量淋巴细胞毒分型技术；单抗法为一步法单抗分型技术；DNA方法采用顺序特异引物聚合酶链反应(PCR-SSP)技术。结果：所有样本DNA分型均获得成功，重复率100%，分型结果经标准DNA验证和美国加州大学配型中心双盲验证符合；149份样本亚洲板单抗法分型总误差率为2.7%,包括26个单一位点中3个存在第2个位点，1个位点分型错误。血清学分型147份样本，8个位点判断错误，30个单一位点中13个存在第2个位点，2例杂合子经DNA分型证实仅1个位点，总误差率15.6%。结论：PCR-SSP用于HLA-A抗原分型快速、精确，明显优于血清学方法，适合于临床应用。大样本量的检测推荐采用亚洲板单抗法分型，对单一位点和判断困难者需要经DNA分型确认。

A comparative study of serological， monoclonal antibody and DNA typing in identifying HLA-ATan Jianming,Tang Xiaoda,Ding Yande, et al. Renal Transplant Center,Shanghai First People's Hospital,Shanghai200080

AbstractObjective:A double-blind study was carried out to evaluate the accuracy and reliability of PCR-SSP assay in comparison with serology and monoclonal antibody(mAb) typing in identifying HLA-A alleles in Southern Chinese population. Methods:A total of 296 samples were entered into the study, including 143 unrelated kidney donors and 153 recipients.HLA-A typing was performed by standard two-stage microlymphocytotoxicity assay, one-step mAb typing and PCR-SSP typing.Results:All samples were successfully typed by PCR-SSP.Reproducibility was 100%.The results were confirmed by a panel of standard DNAs and a double-blind typing of UCLA tissue typing lab. However,mAb typing(for Asian) in 149 samples showed 2.7% misassignment including 1 antigen being incorrectly interperted and 3 of 26 “blanks" turning out to be definable alleles by DNA typing. Serological discrepancy rate was 15.6% in 147 samples consisting of 8 antigens being incorrectly interpreted, 13 “blanks" turning out to be definable alleles and 2 heterozygotes turning out to be homozygotes by DNA typing.Conclusion: HLA-A typing by PCR-SSP proved to be a rapid and accurate technique, suitable for clinical application with a greater precision than serology.In large scale screening, mAb typing (for Asian) is recommended.Antigens of “blanks" or “difficult" by serology or mAb typing should be retyped by DNA typing.

Key wordsAntigens，HLA-ASerologyAntibody，monoclonalDNA typing Transplantation

人类白细胞抗原(HLA)Ⅰ类A抗原的分型传统上以标准血清学方法为主。近年来随着分子生物学技术的发展，国外相继建立起单克隆抗体分型技术(单抗法)和DNA分型方法。为比较三种分型方法对中国汉族人群A抗原分型结果，我们在建立顺序特异引物聚合酶链反应(PCR-SSP)技术DNA分型的基础上，同步双盲比较血清学方法和单抗法，对143名无关供者和153例等待肾移植受者的HLA-A抗原分型结果进行对比分析。报道如下。

病例和方法

1样本无关供者143名，等待肾移植受者153例，均为汉族南方籍人群。采集肝素抗凝外周血5ml，分离淋巴细胞，编号。一份由本中心移植免疫室专人进行血清学分型或单抗法分型［包括血清学分型147份、单抗法(亚洲板)分型149份］；另一份由分子生物学实验室专人进行DNA分型，共296份样本；A1～A74标准DNA由美国加州大学(UCLA)组织配型中心提供。

2血清学分型方法采用标准微量淋巴细胞毒技术^［1］。淋巴细胞分型盘购自美国Tray-type Diagnostics公司，分型方法按试剂盒程序操作。

3单抗法分型方法按Lee等1994年报道的一步法单抗分型方法^［2］操作。淋巴细胞分型盘(亚洲板ASN72D)购自美国One Lambda公司。

4DNA分型方法采用PCR-SSP方法。模板DNA提取为快速盐析法^［3］。根据HLA-Ⅰ类核苷酸序列设计合成30个特异引物和2个阳性对照引物，组成20个PCR反应。常规琼脂糖凝胶电泳后即可准确分辨出A1～A74共20个等位基因。反应条件与扩增温度详见文献［4］。分型结果经标准DNA和美国UCLA配型中心双盲验证。

结果

1DNA分型结果296份样本DNA采用PCR-SSP行HLA-A抗原分型均获得成功(其中2份因供者腹腔血抽提DNA质量差未获结果，改用脾细胞抽提DNA分型获得成功)。检出A位点等位基因总数550个，其中单一位点42例，杂合子254例。无假阳性和假阴性出现。分型结果经标准DNA验证符合，阳性样本40份随机编号送美国UCLA双盲验证符合。A位点19个等位基因每位点重复5次均获相同结果，重复率100%。检测时间为5小时(包括模板DNA提取2小时，扩增2小时，其它1小时)。本方法可分辨的特异性A抗原20个，实际检出汉族南方籍人群特异性A抗原13个，其中A23、A25、A34、A36、A43、A66和A69无阳性样本。

2血清学分型结果147份样本采用血清学方法同步双盲行HLA-A抗原分型均获得成功，总耗时4小时。检出A抗原单一位点30个，其中13个经DNA分型证实存在第2个位点；另有2例血清学分型有2个位点，而DNA分型仅1个位点；8个位点血清学分型结果与DNA分型结果不同，经重复实验证实系血清学分型结果错误。血清学分型总误差为23例，误差率15.6%。

3一步法单抗分型结果149份样本采用亚洲板单抗法同步双盲行HLA-A抗原分型，全部获得成功，总耗时3小时。检出A抗原单一位点26个，其中3个经DNA分型证实存在第2个位点；1个位点与DNA分型结果不同。总误差4例，误差率为2.7%。

4总体比较血清学方法或单抗法与DNA分型结果共有27例分型错误，其中16个位点血清学或单抗法未分辨出来(只有1个位点，另1个为空白)，DNA分型证实这16个位点是1个A1，3个A3，2个A11，2个A68，1个A30，2个A31，1个A32和4个A33；9个位点血清学或单抗法分型结果与DNA分型结果不同，包括1份A30，DNA分型证实为A74，4份A31，DNA分型证实为A30，3份A33，DNA分型证实1份为A31，2份为A30，1份A74，DNA分型证实为A68；2例血清学分型为A2/A29，A11/A33，而DNA分型为A2和A11单一位点。

讨论

1人类主要组织相容性复合体Ⅰ类分子在器官移植、免疫应答、与疾病关联以及肿瘤的发生发展中发挥重要作用。Ⅰ类抗原的分型是研究工作的基础和重要手段，也是筛选器官移植和骨髓移植合适供、受者的主要方法。自60年代初期Terasaki创立微量淋巴细胞毒分型技术以来，血清学方法一直是Ⅰ类抗原的经典分型方法。随着对Ⅰ类分子核苷酸序列分析的不断深入，新确立的特异性逐年增加，血清学方法已无法获得能够分辨出所有特异性的标准抗血清。血清学之间的交叉反应，尤其是A19分裂子之间较强的交叉反应以及淋巴细胞膜抗原的弱表达，常常使分型出现技术上的困难和判断误差。近年来国外DNA分型的比较研究显示血清学方法对A抗原分型仍有一定的误差。如Bozon等^［4］报道56例白种人群A抗原DNA分型显示血清学误差率达7.1%；Mytilineos等^［5］对234例肾移植供、受者的研究显示，血清学用于A抗原分型的误差率供者为9.2%，受者为3.9%；本组单抗法亚洲板误差率为2.7%。因此，寻找更加精确可靠、简便快捷、适合于临床应用，尤其是我国汉族人群的HLA分型方法是移植免疫学与免疫遗传学领域的重要课题。

2本项研究首次比较分析血清学方法、单抗法和DNA方法对我国汉族南方籍人群HLA-A抗原分型结果。总体比较显示：296份样本血清学或单抗法分型出现A抗原单一位点56个，其中16个经DNA分型证实存在第2个位点；共有11个位点分型错误。在总计27个分型错误结果中，A19分裂子高达18个，占66.7%。分项比较显示：DNA分型最为精确可靠、重复性好、样本与试剂来源方便易得、不需要活的淋巴细胞，尤其适合于尸体器官的移植，但检测时间较长。模板DNA提取的质量好坏是DNA分型成败的关键，本组有2名供者的腹腔血未提到模板DNA，改用脾细胞提取才获得成功。亚洲板单抗法分型具有较高的准确性，误差率仅为2.7%，且操作简捷、耗时短，尤其适合于大样本量的检测，例如筛选异基因骨髓移植的供者，但试剂需要进口，仍然需要活细胞，使样本来源受到一定的限制。主要根据白种人群设计的标准血清学方法用于我国汉族人群检测存在较高的误差率(达15.6%)，且样本与试剂的来源受到一定的限制，标准抗血清的筛选和血清板的运输与保存均有一定的难度。实验结果表明，PCR-SSP行HLA-A抗原DNA分型具有高分辨度、高特异性、相对简便快捷的特点，结果精确可靠、重复性好，明显优于血清学方法，适合于临床应用。对于大样本量的检测推荐采用亚洲板一步单抗分型法进行筛选，当出现A抗原单一位点，或出现明显的交叉反应，尤其是A19分裂子之间的交叉反应而影响结果判断时，有必要采用DNA分型