6-巯基嘌呤(6-MP)是治疗儿童急性白血病的重要药物之一,而巯基嘌呤甲基转移酶(TPMT)又是该药物的代谢关键酶,其活性与疗效密切相关。酶活性是由该酶遗传多态性决定的,而TPMT*2型、TPMT*3型是两种常见的类型,我们通过聚合酶链反应(PCR)检测上海地区30名志愿者DNA,以期发现本地区人群中是否存在此二种多态性。

材料和方法

1材料30份血标本来源于上海地区志愿者,PCR热循环扩增仪为PE2400型,Taq聚合酶购自复旦大学四星公司,其它PCR试剂购自华美生物工程公司,引物序列由美国St Jude儿童医学中心提供,由赛百胜公司合成,其序列如下:

T2W: 5′-GTATGATTTTATGCAGGTTG-3′

T2M: 5′-GTATGATTTTATGCAGGTTC-3′

T2C: 5′-TAAATAGGAACCATCGGACAC-3′

T2W为野生型引物；T2M为突变型引物；T2C为公共引物。

2方法

2.1DNA制备:取志愿者外周血2～3ml,20%乙二胺四乙酸二钠 (EDTA) 抗凝, 用简易法提取基因组DNA, -20℃保存。

2.2序列特异引物-聚合酶链反应(PCR-SSP):总体积25μl,基因组DNA 150ng,10×PCR缓冲液［50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl₂,10mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）, 0.001%明胶］，dNTP1.25mmol/L,引物12.5pmol(特异引物分两管，分别为野生型和突变型),Taq聚合酶0.5U,混匀,石蜡油覆盖。95℃变性30秒，55℃退火40秒，72℃延伸50秒，最后72℃延伸5分钟。

2.3扩增产物分析:PCR产物经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳,电压4～5V/cm,缓冲液1×TBE,45分钟后浸泡于0.5μg/ml溴化乙锭中染色10分钟,紫外灯下观察并摄片分析。

结果

130名志愿者标本经PCR扩增,产生特异性的等位基因条带。根据引物设计,所扩增条带大小为254bp,无论是野生型还是突变型的扩增产物片段大小均一致,但它们的条带只有一个碱基的差异且均位于3′末端。正常标本即野生型纯合子经两条引物退火后产生一条条带,突变型杂合子经两条引物退火扩增后均有条带出现。本实验未发现突变型纯合子条带。野生型及突变型杂合子条带如附图所示。

M为突变型；W为野生型；N为DNA标记(pGEM3zf/HaeⅢ)；下标号为标本号

1，2，4，5为野生型；3，6为TPMT*2型杂合子

附图野生型及突变型PCR扩增结果

2TPMT遗传多态性分型30份标本中28份为正常野生型,称为TPMT*1型,2份为TPMT*2型杂合子,未发现纯合子,也未发现其它类型的多态性(TPMT*3等)。

讨论

6-MP作为一线药物和甲氨喋呤(MTX)等联合用于儿童急性淋巴细胞白血病的维持治疗,疗效良好。但临床发现有10%～20%的患者在使用该药物时出现较严重的不良反应,主要表现为显著的造血功能受抑制。近年来,国外学者发现不良反应的出现和6-MP的代谢关键酶TPMT密切相关。研究结果表明:①当TPMT活性高,产生甲基化产物多，则不良反应相对低,但易出现复发;而当TPMT活性低时不良反应大,但复发少^［1］。②TPMT遗传多态性是DNA编码顺序单个点突变造成的。它包括三种类型:TPMT*1为野生型；TPMT*2型则是由于开放阅读框架第238位碱基G→C,导致第80位丙氨酸(Ala)→脯氨酸(Pro)；TPMT*3型是由于开放阅读框架第460位碱基G→A,第719位碱基A→G,分别导致形成多肽链154位丙氨酸(Ala)→苏氨酸(Thr),240位酪氨酸(Tyr)→半胱氨酸(Cys)，由此引起酶活性改变^［2］。我们对30份标本进行PCR检测,发现2份为TPMT*2型突变型杂合子。同时,也进行TPMT*3突变型检测,但未发现突变型。我国是否存在TPMT*3突变型，尚有待于进一步深入探索。

PCR-SSP法检测TPMT遗传多态性的最大特点是引物设计具有高度分辨率,它可分辨出TPMT*2的纯合子和杂合子的等位基因,并且对单一碱基替代亦可进行检测,文献报道它对某些用序列特异寡核苷酸探针杂交-聚合酶链反应(PCR-SSOPH)方法不易区别的基因型也可进行分辨^［3］。同时,PCR-SSP将扩增和检测两个步骤合二为一,使操作过程更为简便、快速,在模板DNA制备后2小时便可获得检测结果。总之，此方法是一种适用、易操作的基因分型方法,具有推广应用价值

参 考 文 献

1Krynetski EY,Schuetz JD,Galpin AJ,et al.A single point mutation leading to loss of catalytic activity in human thioparine S-methyltransferase. Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:949-953.

2Lennard L, Gibson BES,Nicole T,et al.Cogenital thioparine methyltransferase deficiency and 6-mercaptopurine toxicity during treatment for acute lymphoblastic leukemia. Arch Dis Clin,1993,69:577-579.

3Tai HL,Krynetski EY,Krynetskaia NF,et al.Thioparine S-methyltransferase deficiency:two nucleotide associated with loss of catalytic activity in Caucasians. J Hum Genet, 1996,58:694-698.

(收稿：1997-07-25修回：1998-02-09)

(校对：张志方)