高三尖杉酯碱(HHT)是从三尖杉属植物中分离出来的一种生物碱，临床上广泛地用于急性粒细胞白血病、急性单核细胞白血病等的治疗。我们以K562细胞为材料，观察HHT对白血病细胞的杀伤模式及其引发的细胞死亡形式，以进一步研究HHT对白血病细胞损伤的机制。

材料和方法

1主要试剂优质小牛血清购自杭州四季青生物制品研究所，琼脂糖、蛋白酶K、RNA酶为上海华美公司产品，RPMI 1640粉购自Gibco，原位细胞凋亡检测试剂盒为Boehringer Mannhem(德国)产品，HHT为杭州民生药厂产品。

2细胞系及培养条件K562细胞株(引自中国科学院上海细胞研究所)接种于含10%小牛血清、100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养液，在37℃、5%CO₂条件下培养。取对数生长期细胞，更换培养液并加药处理一定时间后进行实验。以0.2%台盼蓝染色，染色阳性细胞为坏死细胞。

3细胞DNA提取及电泳参照文献［1］，2×10⁶个细胞加入50μl裂解液(10mmol/L Tris-HCl,10mmol/L EDTA,10mmol/L NaCl,0.5%SDS及0.5mg/ml蛋白酶K)，50℃保温1小时，再加入10μl RNA酶(1mg/ml),50℃继续保温2小时，加入2mol/L NaCl 60μl，混匀，离心取上清，用95%乙醇沉淀，离心后，取沉淀物加5μl上样缓冲液，在1.8%琼脂糖凝胶上电泳6小时，紫外光下观察并摄影。

4细胞形态观察收集适量细胞，经3%戊二醛固定，锇酸再固定，脱水，包埋，切成60nm超薄切片，用醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，透射电镜下观察并照相。

5DNA片段原位末端标记检测凋亡细胞收集适量细胞，涂片后按试剂盒说明书进行操作，光镜下观察凋亡阳性细胞，计数200个细胞并计数阳性率。

6流式细胞仪测定DNA含量及细胞周期分析收集细胞，70%乙醇固定，50μg/ml RNA酶37℃消化1小时，65μg/ml碘化丙锭(PI)4℃染色1小时，FACS420流式细胞仪进行细胞周期分析。低于G₁期DNA含量的细胞为凋亡细胞群。

结果

1细胞形态变化与对照细胞比较，K562细胞经一定浓度HHT作用后，出现一系列形态变化：染色质浓聚，形成致密的染色质团块并沿核膜边聚，胞质空泡化，继之核固缩，碎裂成大小不同的核物质，渐渐被胞质和包膜成分包裹形成凋亡小体。

2DNA凝胶电泳0.05～400μg/ml HHT处理K562细胞24小时，DNA电泳均可见清晰的阶梯状DNA条带，其第一条带约为180～200bp，依次倍增，说明在核小体连接处的DNA被随机切断产生寡聚核小体，而未经HHT处理的对照细胞不显示阶梯状条带。HHT处理细胞及对照细胞台盼蓝拒染率均在90%以上。

3K562细胞凋亡与HHT的浓度和作用时间关系将细胞与1μg/ml HHT孵育不同时间，以及与不同浓度的HHT孵育24小时，用DNA片段原位末端标记法检测凋亡细胞百分率，结果可见细胞凋亡百分率随时间增加而迅速地上升；浓度在1μg/ml以上时曲线上升比较平缓。

4细胞周期细胞凋亡后形成凋亡小体，导致细胞内DNA的丢失，在流式细胞仪检测的DNA组方图，将出现低于G₁期DNA含量的亚G₁峰。结果表明，从第9小时开始，凋亡细胞百分率逐渐增加，G₁期细胞逐渐减少，同时伴随S期细胞增加，G₂/M期稍减少；到48小时，细胞周期各期分布接近对照组(附图)。

附图HHT(50μg/ml)作用不同时间细胞周期变化

讨论

HHT达浓度的“阈”值时能诱导白血病细胞K562发生与时间相关的不可逆凋亡。用台盼蓝染色与坏死细胞鉴别表明，HHT主要通过特异性诱导凋亡，而非坏死杀伤靶细胞。

HHT在诱导K562细胞凋亡时，表现为G₁期细胞明显减少，提示HHT主要诱导G₁期细胞凋亡；同时S期细胞增加，G₂/M期细胞相对减少，表明S、G₂/M之间存在阻滞。HHT诱导48小时，各期细胞比例接近对照组，提示部分S期细胞克服了S-G₂/M阻滞点，进入下一个细胞周期，从而改变细胞各期比例。我们推测，这部分细胞可能是对HHT不敏感的细胞群。

本课题受浙江省自然科学基金(395126)资助

参 考 文 献

1Skladanowski A,Konopa J.Adriamycin and daunomycin induced programmed cell death(apoptosis) in tumour cells.Biochem Pharmacol,1993,46:375-382.

(收稿：1997-08-04修回：1998-02-19)

(校对：王汝瑞)