钙磷DNA沉淀法转染我组构建的重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)pMEneo质粒进入中国仓鼠卵细胞(CHO)，经G418选择后得到稳定表达GM-CSF的阳性克隆。对持续3个月的不同浓度G418维持培养与rhGM-CSF表达水平进行相关性分析。

材料和方法

1主要试剂G418购自LIFF公司；MTT为Sigma公司产品；rhGM-CSF阳性对照品(1×10⁷U/mg)由四川省肿瘤研究所康龙公司提供。

2质粒及细胞株pMEneo和pCDhGM-CSF质粒由东京大学新井和横田教授赠送。pMEneo-hGM-CSF质粒的重构和鉴定另文介绍(暂未发表)。人红白血病细胞系TF1为四川省肿瘤研究所提供，用含有10%新生牛血清(NCS)、＞10ng/ml的rhGM-CSF和100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的RPMI 1640培养液培养；CHO细胞购自上海中国科学院细胞生物学研究所，用RPMI 1640培养液培养，NCS和青、链霉素浓度同上，不含造血因子。

3G418筛选CHO-rhGM-CSF细胞系rhGM-CSFpMEneo质粒经钙磷转染法转染CHO细胞48小时后进行G418筛选，起始浓度为200μg/ml,每隔3～4天换液，G418浓度也由200μg/ml递加至400μg/ml、1000μg/ml。当G418浓度递加至1mg/ml时，对照CHO母系细胞全部死亡，转染的CHO细胞出现克隆，为时14～18天。G418浓度保持800μg/ml,筛选扩增部分克隆。经细胞增殖测定，选择GM-CSF表达水平较高的三株克隆6-1，6-2，6-5作稳定传代观察实验。

4CHO-rhGM-CSF细胞系培养上清的收集克隆6-1，6-2，6-5传代起始细胞浓度为5×10⁴/ml。各克隆分别选用0，300，600μg/ml G418维持，10ml培养瓶静态培养。每隔3～4天传代1次，分别收集上清待测。再重复上述培养，历时3个月，传代20～26次。

5rhGM-CSF生物活性测定采用TF1细胞增殖法即MTT测定法。MTT测定时，TF1细胞用4%NCS的RPMI 1640洗2～3次并调制细胞为1.2×10⁵/ml浓度，96孔板，每孔100μl 4%NCS的RPMI 1640培养液中，含5μl待测CHO-rhGM-CSF细胞系培养上清和6×10³细胞，37℃ 40～44小时孵育后，每孔加10μl 5mg/ml的MTT，再培养3～4小时后，用盐酸异丙醇裂解，在微板读数机(Bio-Rad)570nm处测吸光度(A，曾称光密度OD)。阳性对照取饱和浓度。活性单位测定时，取待测上清作倍量稀释，阴性对照至饱和浓度之间，A_570nm半值时GM-CSF的量为一个活性单位^［1］。

结果

不同浓度G418维持培养对转染阳性的克隆细胞表达GM-CSF的影响对三株阳性克隆进行了为期3个月、共26代(克隆6-5为20代)稳定性观察，方差分析结果表明不同的G418维持选择条件对克隆株表达分泌rhGM-CSF无明显影响，克隆6-1和克隆6-2F_0.05(2.75)=3.11,F_0.01(2.75)=4.88；克隆6-5 F_0.05(2.57)=3.15,F_0.01(2.75)=4.98，均无明显差异(P值均＞0.05)。附图为实测数据，每个克隆每3周测6次，

附图3个月内不同浓度G418对转染阳性的克隆细胞

表达GM-CSF的影响

取平均值、标准差。直观地显示出经3个月的传代培养，无论有无G418选择压力存在，或剂量大小，都对CHO稳转细胞株表达和分泌rhGM-CSF无明显影响。活性可达1×10⁴U/ml。

讨论

G418选择系统在原虫作宿主时，因其宿主体系的局限性，拷贝量小，外源基因很少整合进宿主染色体，需长期加压G418才能维持其稳定性^［2］。我们的实验显示，哺乳动物细胞作宿主时，经磷酸钙-DNA共沉淀法转染CHO细胞株，经G418(800μg/ml～1mg/ml)筛选出的三株克隆，在长达3个月的培养中，无论有无G418选择维持，都表现出较好的稳定性。有人曾报道CHO-rhIL-2克隆株也有相同表现^［3］。这种稳定性在长期规模培养中非常重要。三株克隆培养上清经MTT测定，有效地刺激了GM-CSF依赖细胞株TF1的增殖。与阳性对照相比较，原液活性可达1×10⁴U/ml。

本次实验结果表明：我们建立的CHO-rhGM-CSF克隆株表达活性高，稳定性好；在去除选择压力的情况下，稳转株能在3个月中保持稳定，说明用以真核细胞作宿主获取重组人细胞因子，G418选择系统具有实用价值。尤其在科研工作中，G418选择系统因其不局限于特定的细胞，更有其优势。在以后的工作中，我们将进一步考察其长期相关性。

志谢：感谢王憬惺研究员、肖小璞副主任技师、余蓉副研究员对本工作的指导、协调与帮助

参 考 文 献

1朱振齐，刘进，马大龙，等.人重组GM-CSF/HSA-D3嵌合蛋白(GM-HSA)在大肠杆菌中的表达及其产物稳定性的研究.生物化学杂志，1996，12：284-288.

2Hamamm L,Nickel R,Tannich E.Transfection and continuous expression of heterologous genes in the protozoan parasite Entamoeba histolytica.Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:8975-8979.

3Niwa H,Yamamura K,Miyazaki J.Efficent selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.Gene,1991,108:193-200.

(收稿：1997-04-07修回：1997-10-15)

(校对：仵乾玉)