有研究发现真性红细胞增多症(真红)的有核红细胞的生存时间明显长于正常人，真红的异常集落对IL-3、SCF和IGF-1等都高度敏感，而这些细胞因子均能延缓红系祖细胞发生细胞凋亡。为探讨真红在细胞凋亡方面是否与正常人有所不同，我们将真红患者及正常对照的外周血单个核细胞在不加细胞因子条件下培养，进行细胞凋亡和bcl-2表达的检测。

材料和方法

1血标本来源所有患者均为在我院就诊的真红患者，真红的诊断依据《血液病诊断及疗效标准》^［1］。正常对照为同期血库的正常献血员。

2外周血单个核细胞在未加细胞因子条件下的培养取一定量的新鲜、抗凝外周血，经淋巴细胞分离液分出单个核细胞，以1×10⁶/ml的细胞密度加入IMDM(购自Gibco-BRL)中，内含30%胎牛血清、1%牛血清白蛋白、1.5mmol/L 谷氨酰胺、10^－5mol/L 2-巯基乙醇(均购自Sigma公司)，在37℃、5%CO₂条件下培养。

3DNA提取按文献［2］方法提取DNA，于1%琼脂糖凝胶，1×TAE，40V条件下电泳2小时。

4Hoechst 33342染色将1×10⁶细胞用含10%血清的培养基悬浮后，加10 μl Hoechst33342储存液(0.1 mg/ml),室温下7分钟，将细胞在冰上冷却片刻，离心沉淀。用1ml PBS 重悬细胞，在荧光显微镜下观察。

5电镜观察将细胞固定后，在JEM2000-EX透射电镜下观察细胞超微结构。

6DNA片段测定按文献［3］的方法测定。

7bcl-2表达的测定将真红患者和正常对照的外周血单个核细胞于未加细胞因子条件下培养48小时，收集此时的细胞，提取RNA。测定A(吸光度，曾称光密度OD)₂₆₀值、A₂₈₀值，电泳鉴定有无降解，转至尼龙膜。

8探针制备含bcl-2 cDNA质粒pCR^TMⅡ(美国哈佛医学院孙雷博士惠赠)1.5μg/μl,经EcoRⅡ酶切后电泳鉴定。低熔点凝胶回收。

9探针的地高率(Dig)标记和Northern blot探针的Dig标记和Northern blot均按Boethringer Mannheim公司的试剂盒说明书操作。

结果

外周血单个核细胞在不加任何细胞因子的条件下培养，在培养后24，48小时收集的细胞经Hoechst 33342染色、发现细胞核有固缩和碎片形成。透射电镜检查发现，培养到48小时的细胞有凋亡特征性的染色质成致密的半月形，聚积在核的一侧的表现，DNA琼脂糖电泳可见典型的细胞凋亡的梯形图形。在培养24和48小时后真红患者外周血单个核细胞发生凋亡的程度小于正常对照。

用DNA片段测定法测定真红和正常人细胞凋亡的程度差异。发现真红患者中，培养48小时的细胞DNA片段占DNA总量的6.16%±2.25%，正常人为16.20%±3.28%。经配对t检验，P＜0.001。

为探讨真红患者不易发生细胞凋亡的原因，我们分别将真红患者和正常对照的外周血单个核细胞在不加细胞因子的培养条件下培养48小时后收集细胞，检测bcl-2的表达。以bcl-2 cDNA和β-actin 为探针行Northern blot,发现4例真红患者和正常相比，其条带位置相同，说明无mRNA的剪切异常；通过与内对照β-actin相比，真红患者杂交后条带显影程度明显高于正常对照(附图)，即mRNA的量有明显差异。这提示在相同培养条件下，真红患者外周血单个核细胞bcl-2的表达明显高于正常对照。

PV：真红；N：正常

附图a:总RNA变性凝胶电泳的紫外透射图

b,c:Northern blot电泳图，bcl-2(b)与β-actin(c)相比，

真红患者的bcl-2显色明显高于正常对照

讨论

我们在5例真红患者中发现，其外周血单个核细胞于不加入Epo和其它细胞因子的培养条件下培养，细胞凋亡的发生少于正常对照。但由于试验条件限制，不能将红系祖细胞纯化，所以不能完全排除一些非红系细胞干扰试验结果的可能。

由于未能将细胞纯化成只含红系的细胞，用现有的结果来断定只是红系细胞凋亡异常是不恰当的。但因真红是干细胞疾病，其异常可累及多系细胞，甚至是淋巴细胞^［4］。所以，实验结果可反映红系细胞的情况。

1995年有人作类似的报道：在真红患者中，其外周血的红系祖细胞能抵御在无Epo条件下的细胞凋亡，在无Epo时能继续分化^［5］，这和我们的观察结果一致。

在本研究中，我们首次发现在经相同条件处理后的外周血单个核细胞中，真红患者bcl-2的表达高于正常人。虽然我们尚不明确这群细胞中何种细胞存在着差异，也不明确是细胞本身bcl-2的表达增高，还是在这种缺乏细胞因子的条件下诱发了bcl-2基因的表达，但这种bcl-2高表达的结果至少可部分解释真红患者外周血单个核细胞的细胞凋亡少于，并迟于正常人。bcl-2 高表达的原因尚待进一步探讨。

总之，真红患者和正常对照在缺乏细胞因子的培养条件下均发生细胞凋亡，但发生程度不一，真红患者的细胞凋亡少于正常对照。这种差异可能与bcl-2的高表达有关。

参 考 文 献

1张之南主编. 血液病诊断及疗效标准. 第1版. 天津：天津科学技术出版社，1991.128.

2J 萨姆布鲁克，等.分子克隆实验指南.第2版. 北京：科学出版社，1992.

3Kazuyuki I,Toshio M,Takizawa T,et al.Differential expression of bcl-2 and susceptibility to anti-fas-mediated cell death in peripheral blood lymphocytes,monocytes,and neutrophils.Blood,1994,81:1201-1208.

4Prchal JF,Guan YL.Transcriptional analysis of the active X-chromosome in normal and clonal hematopoiesis.Blood,1993,269-271.

5Moliterno A,Hankins WD,Spivak JL,et al.In vitro growth and differentiation kinetics of peripheral blood progenitor cell in polycythemia vera.Blood,1995,86(Suppl):185.

(收稿：1997-04-10修回：1998-01-04)

(校对：张吉贤)