摘要目的：探讨全反式维甲酸(ATRA)和9-顺式维甲酸(9-cis RA)对HL-60细胞Fas表达水平及维甲酸对抗Fas抗体诱导的细胞凋亡敏感性的影响。方法：用流式细胞仪检测HL-60细胞膜Fas蛋白表达水平；分别采用形态学观察、DNA电泳和流式细胞仪检测抗Fas抗体诱导的细胞凋亡。结果：HL-60细胞Fas弱表达。经10^-6mol/L ATRA或9-cis RA分别预处理4天后，HL-60细胞Fas表达水平及对抗Fas抗体诱导凋亡的敏感性均显著提高。9-cis RA提高HL-60细胞对抗Fas抗体诱导凋亡的敏感性的能力强于ATRA。结论：维甲酸可上调HL-60细胞表达Fas，这可能与维甲酸诱导HL-60细胞分化相关。进一步深入探讨其分子机制，将为肿瘤治疗，特别是自体骨髓移植中骨髓净化提供新方法。

Retinoic acid inducing Fas expression in HL-60 cells Zeng Hui, Zhao Xiangyin, Ma Yaluan, et al. Department of Hematology, Beijing Tongren Hospital, Capital University of Medical Sciences, Beijing100730

AbstractObjective: To investigate the effect of all-trans retinoic acid (ATRA) and 9-cis retinoic acid (9-cis RA) on the expression of Fas and the sensitivity to anti-Fas induced apotosis in HL-60 cells.Methods: Fas expression was detected by flow cytometry. Anti-Fas induced apoptosis (AFIA) was determined by morphological features, DNA fragment electrophoresis, and flow cytometric cell cycle analysis. Results: Fas antigen was weakly expressed on HL-60 cells. After incubation of HL-60 cells with 10^-6mol/L ATRA or 9-cis RA for 4 days, both the Fas expression and AFIA were significantly enhanced. 9-cis RA was more potent than ATRA in increasing the sensitivity to AFIA.Conclusion: RA might upregulate Fas expression. Further elucidation of its molecular mechanisms might provide a rationale for new therapeutic strategies of malignant diseases.

Key wordsApoptosisTretinoinCell line, HL-60Gene, fas

Fas(又称APO-1，CD₉₅)是一种传递细胞凋亡信号的Ⅰ型跨膜蛋白^［1］。Fas配体(Fas-L)或Fas抗体与膜Fas结合后，凋亡信号传递到细胞内，诱导细胞凋亡，因此，Fas-L或Fas抗体有望用于治疗肿瘤。目前，在体外和小鼠体内利用Fas抗体诱导肿瘤细胞凋亡均已获得成功^［2］。但是，某些肿瘤细胞由于Fas表达的缺失或功能的缺陷而对Fas抗体诱导的凋亡具有抗性^［3］，限制了Fas抗体的应用。诱导Fas抗原功能性表达是解决这一问题的重要手段。我们在研究分化诱导剂全反式维甲酸(ATRA)和9-顺式维甲酸(9-cis RA)诱导HL-60细胞凋亡，降低Bcl-2表达的基础上^［4］，进一步研究其对Fas表达的影响。

材料和方法

1细胞培养HL-60细胞培养条件与文献［4］相同。取指数生长期细胞进行试验。维甲酸(RA)处理的细胞在培养基中分别加入10^-6mol/L ATRA或9-cis RA(均由瑞士Roche公司赠送)。

2抗体用于流式细胞仪检测的生物素标记的鼠抗人Fas单克隆抗体DX2(IgG1)和用于诱导细胞凋亡的鼠抗人Fas单克隆抗体CH11(IgM)均由美国Tong Zhou博士惠赠。

3流式细胞仪检测Fas表达水平RA处理不同时间后收集细胞，间接免疫荧光标记法检测。一抗为生物素标记的鼠抗人Fas单克隆抗体DX2 ，阴性对照加入等量生物素标记的非特异性鼠抗人IgG1，4℃孵育1小时后，加入FITC标记的streptavidin (Sigma) 4℃避光孵育1小时，用FACS 420型流式细胞仪进行分析。

4HL-60细胞对抗Fas抗体诱导凋亡的敏感性取正常生长及经RA作用不同时间的HL-60细胞，调整细胞密度为1×10⁶/ml，移至24孔板中，在培养液中分别加入50～200ng/ml 鼠抗人Fas单克隆抗体IgM(clone CH11)，对照细胞加入等量非特异性鼠IgM，37℃继续培养，分别于0，1，2，3，4小时收集细胞，按下列方法检测细胞凋亡。形态学观察：常规离心涂片，HE染色，光镜观察。DNA凝胶电泳：采用快速法^［5］提取DNA，1%琼脂糖凝胶电泳。流式细胞仪检测凋亡细胞：采用碘化丙锭(PI)染色法^［4］，FACS420型流式细胞仪进行细胞DNA含量分析，低于G₀(G₁)期细胞DNA含量的细胞为凋亡细胞。

5统计学分析流式细胞仪检测每份标本收集1×10⁴个细胞。所有实验均重复3次，平均值采用Systat统计软件进行分析。

结 果

1HL-60细胞Fas表达的变化经RA诱导4天后，免疫荧光染色流式细胞仪检测表明荧光强度显著提高(图1)，表明Fas阳性细胞比例增高，表达强度增强。

2RA对Fas抗体诱导HL-60细胞凋亡敏感性的影响

2.1抗Fas抗体诱导未经RA处理的HL-60细胞凋亡：经抗Fas抗体作用2小时后，HE染色可见典型凋亡细胞，其特征为细胞体积缩小，胞浆浓缩，胞核固缩，染色质凝集，核碎裂，“凋亡小体”形成；DNA电泳显示出明显的阶梯状条带(图2)，在流式细胞仪检测直方图上出现DNA含量低于G₀(G₁)期细胞的亚二倍体细胞群，即凋亡细胞群。说明抗Fas抗体具有诱导HL-60细胞凋亡的作用。在50～200ng/ml的浓度范围内，抗Fas抗体(IgM)诱导细胞凋亡具有时间依赖性和剂量依赖性(P值分别为0.004，0.005)。但这种诱导凋亡能力较弱，在实验观察的浓度和时间范围内，细胞凋亡数目最高值为18.3%，并且100ng/ml与200ng/ml的作用在统计学上无显著性差异(P值为0.424)。因此我们选用100ng/ml为后续实验浓度。

1～3:未经RA处理，100ng/ml抗Fas单抗分别作用1，2，4小时；4～6：9-cis RA处理4天，100ng/ml抗Fas单抗分别作用1，2，4小时；7～9：ATRA处理4天，100ng/ml抗Fas单抗分别作用1，2，4小时；M：DNA HindⅢ分子标记

图2DNA琼脂糖凝胶电泳

……为对照，——为Fas荧光强度；a:未经RA处理；b:ATRA 处理4天；c:9-cis RA处理4天

图1流式细胞仪检测Fas表达2.2RA提高HL-60细胞对anti-Fas诱导凋亡的敏感性：图3所示，经ATRA和9-cis RA处理4天后，在100ng/ml抗Fas抗体诱导下，HL-60细胞凋亡数较对照组显著增加(ATRA: P值为0.018；9-cis RA:P值为0.001)， 峰值分别为对照组峰值的1.76倍和2.45倍。9-cis RA的作用高于ATRA(P＜0.05)。

图3RA处理前、后抗Fas抗体诱导HL-60细胞

凋亡数目的变化

讨论

肿瘤细胞表达Fas，并且Fas具有传递细胞凋亡信号的功能是应用Fas抗体治疗肿瘤的两个必要条件。Fas表达的缺陷(表达缺失或降低、基因突变)和功能的缺陷(细胞内凋亡信号传导途径异常、抗凋亡因素的存在)都会造成对抗Fas抗体诱导的凋亡产生抗性。我们检测了抗Fas抗体诱导HL-60细胞凋亡的能力，发现虽然抗Fas抗体可以诱导HL-60细胞凋亡，但HL-60细胞对抗Fas抗体诱导凋亡的敏感性较弱，增加抗体浓度已不能显著增加凋亡细胞的数目。经RA预处理后，HL-60细胞不仅Fas表达增强，抗-Fas抗体对其杀伤活性也显著提高，说明诱导的Fas受体具有介导Fas抗体诱导凋亡的功能。

国外有人采用转基因技术提高肿瘤细胞Fas抗原表达获得成功^［6］。但转基因技术尚有很多问题需要解决,目前临床应用暂时受到限制。有文献报道某些细胞因子如TNF-α、IFN-γ可诱导HL-60细胞表达Fas^［7］，但是这些负性造血因子同时可以诱导造血干细胞表达Fas^［8］，临床应用会产生骨髓抑制。而RA有以下优点：①自身可以诱导HL-60细胞分化、凋亡；②可降低Bcl-2表达水平^［4］；③临床应用副作用小，无骨髓抑制。因此，RA诱导肿瘤细胞Fas功能性表达有望拓宽抗Fas抗体应用范围，从受体角度提高了杀伤肿瘤细胞能力。如能用于自体骨髓移植的体外骨髓净化，不仅有望提高骨髓净化效果，还可避免抗Fas抗体体内应用的副作用。

正常髓系造血细胞Fas的表达与细胞凋亡抑制基因bcl-2的表达有相似之处，即与细胞分化程度相关。不同的是，随着细胞分化程度的提高，Bcl-2表达逐渐下降，而Fas表达逐渐提高。终末分化的中性粒细胞不表达Bcl-2，Fas高表达，最终以凋亡的形式被清除^［9］。我们通过实验已经证实RA可诱导HL-60细胞发生与分化相关的凋亡，在此过程中伴随着Bcl-2表达的降低^［4］，由此我们进一步推测通过诱导HL-60细胞分化可能提高Fas的表达。流式细胞仪的检测结果为这一推测提供了证据。

但是，细胞分化本身是一个复杂过程，其中存在着多种基因的表达