迄今对卵黄囊造血的干/祖细胞研究，仅有关于小鼠的报道。我们就人卵黄囊造血及造血干/祖细胞进行初步观察。

材料和方法

1取材取胎龄4周左右的药物流产胚胎，轻消毒后置洁净工作台中解剖分离卵黄囊。

2卵黄囊结构观察用10%福尔马林固定卵黄囊，石蜡包埋后做成4μm组织切片，进行苏木素-伊红染色(HE)后在光学显微镜下观察。

3卵黄囊细胞印片观察将卵黄囊切开，在玻片上直接印片，置4℃冷丙酮中固定30分钟，彻底晾干后做瑞氏-姬姆萨染色及血红蛋白染色观察。

4造血祖细胞培养和细胞形态观察将卵黄囊置于无菌培养皿中，用机械方法切碎，用毛玻璃研磨后经5号针头反复抽吸3次或加入胶原酶(购自Sigma公司),终浓度1mg/ml，置4℃过夜，经RPMI 1640洗涤2次后用Hypaque-Ficoll分离液分离，取界面层细胞，加入IMDM培养液(pH 7.2～7.4，Sigma公司)制备非贴壁细胞悬液。用半固体培养法^［1］进行造血祖细胞体外培养。细胞经离心涂片机涂片，涂片经冷丙酮固定后瑞氏-姬姆萨染色，观察细胞形态。

5单克隆抗体免疫荧光检测将1×10⁷单个核细胞悬液按常规方法加入CD₃₄单克隆抗体(Yale大学惠赠)，置4℃孵育1～2小时，洗涤3次，加异硫氰酸荧光素(FITC)标记的二抗(羊抗鼠)，4℃下孵育40分钟，洗3次，于荧光显微镜下分析计数，胞膜上有3个以上荧光亮点的细胞为阳性细胞。

结果

4周左右胎龄的人卵黄囊为2～3mm²、圆形、淡黄色透明的囊状物，内含卵黄囊液约20～50μl左右。大于4周的卵黄囊壁上可见到纤细的红色血管网络。显微镜下发现卵黄囊中存在一簇簇团块样红色造血岛，随胎龄不同，造血岛的数量和大小亦不同。剪断体蒂时，随卵黄囊液流出的细胞经涂片染色证实为不同阶段的有核红细胞，显示胚胎时期卵黄囊造血通过体蒂与胚芽的血运途径。

卵黄囊组织切片可观察到人卵黄囊为一个囊腔，囊壁由内胚层柱状上皮细胞、中胚层扁平内皮细胞和血细胞3种成分组成。壁层内，部分区域形成血岛，岛内聚集大量造血细胞，其中以中、晚幼红细胞为主，约占0.95，可见到红系分裂象以及同步发育幼红细胞的群体成熟现象，成熟红细胞罕见，亦可见到少量核呈圆形、细胞核染色质细致、核仁不清晰、胞浆量少的细胞。此外，尚见到由扁平内皮细胞围绕造血岛形成的血管。

卵黄囊涂片进一步清楚地显示旺盛的红系造血状态。多数红细胞胞体偏大、胞浆丰富呈巨幼样改变，部分为核分裂畸形及双核、4核甚或8核的幼红细胞。

人卵黄囊内存在造血干/祖细胞由下述实验证实：①红系祖细胞集落形成单位(BFU-E)、粒系祖细胞集落形成单位(CFU-GM)体外半固体培养。培养至第14天可见BFU-E生长，但较骨髓细胞形成的集落小；无CFU-GM集落生长。②用抗CD₃₄抗体经免疫荧光检测3个卵黄囊，CD₃₄^＋细胞为3.75%±0.75%，3例7～8周龄胎肝和正常人骨髓，CD₃₄^＋细胞分别为0.83%±0.25%和0.75%±0.49%。由于例数少，未进行统计学处理。以上检测证实人卵黄囊内存在具有CD₃₄^＋膜标记的造血干/祖细胞。

讨论

研究表明，人卵黄囊造血时期有很高的限制性，仅限于红系造血。人卵黄囊造血期有核红细胞形态呈现巨幼样改变的机制是否与造血环境中叶酸和维生素B₁₂代谢或其它因素有关尚未明了。

Fennie等^［2］指出动物卵黄囊是造血干细胞形成的唯一场所，存在CD₃₄^＋细胞，即造血干/祖细胞。我们不但检测到人卵黄囊中存在CD₃₄^＋细胞膜标记的造血干/祖细胞，而且这些细胞可在体外形成BFU-E。有文献报道小鼠胚胎早期干/祖细胞在体外有形成红系、粒系集落的能力，但我们未培养出粒系集落。

参 考 文 献

1邢佩霓，李梅生，李杞侠，等. 骨髓增生异常综合征各系祖细胞的体外培养观察. 临床血液学杂志，1992，5：63-65.

2Fennie C, Cheng S, Dowbenko D. CD₃₄^＋ endothelial cell lines derived from murine yolk sac induce the proliferation and differentiation of yolk sac CD₃₄^＋ hematopoietic progenitors. Blood, 1995, 86:4454-4467.

(收稿：1997-04-11修回：1997-11-07)

(校对：仵乾玉)