近年来国外已开展用液体培养的方法，在体外模拟红系细胞的成熟、分化过程。我们结合现有条件，改良了国外所建立的两阶段液体培养方法。该方法通过含白细胞介素3(IL-3)和含红细胞生成素(Epo)两阶段培养，可使外周血中的红系爆式集落形成单位(BFU-E)增殖并分化成红系祖细胞集落(CFU-E)，以后逐渐发育成成熟红细胞。该方法可对研究红细胞的发育过程提供帮助。

材料和方法

1两阶段液体培养参照Fibach方法^［1］,第一阶段：取一定量的新鲜、抗凝外周血，经淋巴细胞分离液分出单个核细胞，用IMDM(Gibco-BRL公司)洗2次。然后将细胞以(1～2)×10⁶/ml的细胞密度加入IMDM中，内含20%胎牛血清(中国医学科学院血液学研究所)、1000U/ml IL-3(Kirin公司惠赠)、1μg/ml环孢霉素A(CsA)(Sandos产品)、1.5mmol/L谷氨酰胺(Sigma公司)。37℃、5%CO₂条件下培养6天。第二阶段：取出不贴壁细胞，IMDM洗2次后，以5×10⁵/ml的细胞密度加入IMDM中，内含30%胎牛血清、1%牛血清白蛋白(Sigma公司)、10^-5mol/L 2-巯基乙醇(Sigma公司)、1.5mmol/L谷氨酰胺、10^-6mol/L地塞米松(上海第九制药厂生产)、1μg/ml CsA、2U/ml Epo(Amgen公司)。37℃、5%CO₂条件下培养8天。在第二阶段培养至第4天时，离心分离，取出细胞以4～5ml IMDM重新悬浮细胞，铺于2ml 45%Percoll(Sigma公司)上，2000r/min离心20分钟。取出位于Percoll界面层的细胞，IMDM洗2次后，继续培养或用于其它试验。在培养过程中，每两天取出部分细胞按常规方法行甲基纤维素半固体培养，以鉴定BFU-E和CFU-E的生长情况。同时也将细胞进行Giemsa染色和Lepehne染色(过氧化酶反应)。

2Lepehne染色取2ml溶于96%乙醇中的联苯胺(终浓度0.6%)，加5ml H₂O₂-乙醇溶液(0.5ml30%H₂O₂加4.5ml 70%乙醇)为Lepehne试剂。甲醇固定细胞10分钟，Lepehne液染色5分钟后清水冲洗，Giemsa染色。

结果和讨论

在液体培养的第一阶段，24小时后可发现许多细胞贴附于培养瓶底。由于有CsA的抑制，有一部分细胞死亡，呈不规则形或在倒置显微镜下细胞折光性差。为了明确红细胞分化过程的动态变化，每隔2天取出一定数量细胞，行甲基纤维素半固体培养,鉴定BFU-E和CFU-E。红系集落的识别基于其形成血红蛋白后呈现桔红色，或在一部分集落桔红色不明显时，可用联苯胺染色证实，联苯胺在过氧化氢存在时使血红蛋白呈棕黑色。

从BFU-E和CFU-E的生长曲线可以发现(附图)，培养的起始细胞只有BFU-E的生长，无CFU-E的生长。在第一阶段的第4天，BFU-E最多，随后BFU-E逐渐下降，而且每个集落的细胞数也在下降，说明细胞有一定的分化。在第一阶段培养第6天的细胞，出现CFU-E，在第二阶段，即含Epo阶段的第4天，CFU-E的生长达高峰。随着培养时间的逐渐延长，细胞逐渐成熟分化，在半固体培养中，细胞形成集落的能力逐渐下降，从集落数减少、每个集落的细胞数减少，到形成集簇(＜8细胞)，直至无集落形成。

附图BFU-E和CFU-E生长曲线(第6天起为第二阶段)

随着细胞分化，细胞内逐渐形成血红蛋白，从液体培养中取出细胞行Lepehne染色可以证实。该方法在原理上与染红系集落的联苯胺染色相同，但细胞用该方法染色后可再用Giemsa染色使细胞核着色，适于对液体培养中的细胞进行形态观察。细胞呈蓝黑色，表明细胞内有血红蛋白。

通过Giemsa染色证实在第二阶段红系细胞有从原红向晚红及至成熟红细胞的发展过程，最终在加Epo后第12～14天发育成成熟红细胞。Giemsa染色可发现细胞已脱核。在体外培养中，由于营养、细胞因子等难于维持较长时间,所以使细胞形态与正常人体内的成熟红细胞略有差异。

在液体培养中，尤其是在第二阶段，如小心操作，避免摇动，可发现有些悬浮细胞呈团簇状生长，提示可能是从一个细胞分化而来。

因CFU-E从形态上鉴别有一定困难，在加Epo后第4天，用Giemsa染色不能鉴别出CFU-E，但该期细胞经甲基纤维素半固体培养，证实含较多的CFU-E。将这一时期的细胞经过Percoll离心后，由于红系祖细胞的相对密度小于淋巴细胞，去除了许多淋巴细胞。此时再用甲基纤维素半固体培养鉴定，发现CFU-E数可达328±96/10⁵个单个核细胞，占细胞总数的30%以上。根据不同实验所需细胞量的多少而在起始时取不同的血量，一般在不少于200ml外周血的条件下获取的CFU-E可达10⁵以上。

从培养结果看,该方法可模拟红系细胞在体外的分化过程。有利于研究各种因素如细胞因子等对各阶段红系细胞的影响。国内外已有用类似方法进行珠蛋白基因表达和红细胞表面抗原的研究^［2］。

参 考 文 献

1Fibach E,Manor D,Treves EA,et al.Growth of human normal erythroid progenitors in liquid culture:a comparison with colony growth in semisolid culture.Intern J Cell Clon,1991,9:57-64.

2黄淑帧,Fibach E,顾小锋,等.正常成人外周血红系细胞液体培养-细胞成熟分化与珠蛋白基因表达.中华血液学杂志,1995,16:403-405.

(收稿:1997-07-08修回:1997-10-27)

(校对:王汝瑞)