血液系统肿瘤包含许多基因改变,如已知的myc,ras,mll等癌基因变化,还有绝大部分的基因异常尚待人们去发现。新近发展起来的代表性差异筛选法(Representational difference analysis,RDA)^［1］为探索这些肿瘤的异常基因开辟了新的途径。我们根据自己的实验条件建立并完善了这种筛选DNA差异基因的方法。

材料和方法

1标本取本院1992～1996年各类血液系统肿瘤患者和正常人的骨髓细胞和外周血有核细胞,常规方法提取基因组DNA^［2］,选择6例血液系统肿瘤进行RDA分析,包括毛细胞白血病(HCL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、多发性骨髓瘤(MM)各1例和急性早幼粒细胞白血病(AML-M₃)2例。3名正常人DNA组成正常DNA库。为了鉴定所获得的片段来源,它们是否特异的存在于某类血液系统肿瘤以及是否为某种癌基因(如ras)或免疫相关基因(如TCR),我们选用一些正常人和ALL、HCL、CLL、CML、NHL、AML、MM、HD患者未缓解期DNA和TCRⅤ(V4)、ras基因的聚合酶链反应(PCR)扩增产物与所得到的DNA片段制备的同位素探针进行点杂交。

2RDA所用引物连接子的设计源于文献［1］,由赛百胜公司合成。

第一套：R1 5-AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGAG-3

R2 5-GATCCTCGGTGA-3

第二套：N1 5-AGGCAACTGTGCTATCCGAGGGAG-3

N2 5-GATCCTCCCTCG-3

第三套：J1 5-ACCGACGTCGACTATCCATGAACG-3

J2 5-GATCCGTTCATG-3

3制备Tester和Driver DNA的代表性片段DNA 2μg用BamHⅠ(1μg＞5U)充分消化。连接第一套引物连接子(R1，R2) DNA:消化产物5μl与0.5nmol/L R1和1nmol/L R2在25μl连接反应体系中混合，50℃孵育，在1小时内退火至10℃，加入0.4μl T4 DNA连接酶2U(Weiss单位)，16℃过夜。扩增:将连接R1、R2引物连接子的Tester和Driver进行扩增。50μl PCR体系中以连接产物4μl为模板,引物R1 50pmol/L,Mg²⁺2mmol/L,dNTP 4×200μmol/L，Taq DNA聚合酶2U，10×PCR缓冲液含500mmol/L KCl,500mmol/L Tris-HCl(pH 8.8), 1% Triton X-100。首先72℃预热3分钟，然后加Taq DNA聚合酶，72℃孵育5分钟，每循环95℃1分钟，72℃3分钟，最后一个循环10分钟，共20个循环。Tester需扩增100μl，Driver扩增500μl。Tester与Driver的PCR产物用BamHⅠ(14U)酶切37℃4小时去除连接子。纯化DNA 采用Promage公司的Wizard PCR纯化柱。

4杂交筛选

4.1连接：Tester的纯化产物连接第二套引物连接子(N1，N2)，方法同前。连接产物进行连接后扩增。

4.2杂交：取Tester扩增产物1μl与Driver酶切产物160μl混合(相当于PCR产物的体积比为1∶80)，无水乙醇沉淀，沉淀干燥后溶于4μl Tricine(pH8.0)，加30μl石蜡油覆盖，于95℃变性10分钟，加1μl 5mol/L NaCl，67℃杂交20小时。

4.3杂交后扩增：取上述混合液0.5μl为模板，于50μl相同反应体系中扩增。先72℃5分钟以填平Tester的5末端后加引物N1(0.4μg)扩增，每个循环95℃ 1分钟，70℃3分钟，最后一个循环10分钟，共10个循环。

4.4消化单链DNA：上述PCR产物8μl加32μl 50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，用20U绿豆芽核酸酶消化单链DNA，37℃反应30分钟，95℃ 5分钟灭活酶活性。

4.5再扩增：取2μl酶切产物以同样条件PCR扩增20个循环。

4.6去除连接子：扩增产物用BamHⅠ酶切除连接子后加以纯化。这样完成第一次筛选。

第二次筛选连接第三套引物连接子(J1，J2)，杂交时Tester与Driver的比例为1∶800，第三次筛选连接第二套引物连接子(N1，N2)，杂交时Tester与Driver的比例为1∶8000。每次杂交后的产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染色鉴定^［2］。

5点杂交根据文献［3］的方法 用获得的PCR产物经随机引物法制备同位素探针，在尼龙膜上与筛选标本进行点杂交。

结果和讨论

1RDA方法的建立和改进

1.1Tester和Driver DNA的定量：Lisitsyn用质量比例进行杂交筛选^［1］，我们现有的实验条件使DNA定量无法精确到ng和pg水平，则用体积比例替代质量比例可以获得筛选产物。

1.2杂交筛选时DNA的选择：为了确定DNA的杂交比例，也为提高连接产物的量，我们对连接产物进行PCR扩增，再用扩增产物与Driver杂交可以得到筛选产物(见附图)。而根据文献［1］直接用连接产物进行杂交不能得到筛选产物。

1～6为6例患者标本做Tester时用连接产物的扩增产物进行杂交筛选后扩增出差异产物;7为阴性对照

附图获得差异片段的途径

1.3纯化获得的DNA差异产物：我们用Wizard PCR纯化柱选择150～1500bp的片段用于筛选，方法简便易行，而且Taq DNA聚合酶扩增这一长度范围片段的效率较高。用Lisitsyn提供的常规琼脂糖电泳分离获得DNA的量少^［1］，且方法复杂。

1.4探索Tester和Driver杂交的最佳比例：杂交筛选中，比例分别为1∶80，1∶100，1∶200，1∶800，1∶(5000～8000)时可以扩增出差异产物，而在Lisitsyn要求的1∶(10⁵～10⁶)的比例时不能扩增出来。在筛选时杂交比例过低则不能突出差异序列，过高则可能将差异序列也消减掉，而不能得到扩增产物。实验最终发现小于1∶10000的比例是适宜的。

2用RDA方法获得异常基因RDA建立在差减杂交技术的基础上，通过设置实验组DNA(Tester)和驱赶组DNA(Driver)，液相杂交后将相同的基因序列依次消除掉,经过多次筛选循环，Tester中特有的序列可以得到充分富集，显示出两组DNA之间的差异基因。如果以患者DNA为Tester，正常人DNA为Driver有可能找到癌基因，反之则可能找到抑癌基因或者其它缺失的基因。代表性差异筛选法由于极大地减少了人类基因组的复杂性，从而明显提高了消减杂交的阳性率。用此法可以直接发现基因组DNA的缺失、整合或重排的变化^［4］。

经过上述实验，我们将正常人DNA作Tester，患者DNA作Driver，从1例多发性骨髓瘤患者分离出一个基因片段，此片段与患者本身DNA不能杂交，与正常人DNA可以杂交，说明获得了这例MM的异常基因。且这个基因与TCRⅤ基因高度同源，说明多发性骨髓瘤患者TCRⅤ基因的缺乏。近来发现TCRⅤ(+)细胞可以识别MHC抗原，具有NK样的细胞毒作用,该患者缺乏这种细胞，提示其免疫监视功能的缺陷。因此，RDA方法的建立为探索血液系统肿瘤的发病机制，寻找机体抗肿瘤免疫缺陷的原因，发现新的癌基因和抑癌基因打下了基础。

参 考 文 献

1Lisitsyn NA，Lisitsyn NM，Wigler M.Cloning the differences between two complex genomes.Science，1993，259：946-951.

2薛海鹏，朱平，王丽辉,等.电泳分析基因差异片段的方法学研究.中国优生与遗传杂志，1996，4：22-24.

3萨姆布鲁克著.分子克隆实验指南.金冬雁，黎孟枫译.北京：科学出版社,1989.464-467,483-504.

4Kastury K，Baffa R，Druck T，et al.Potential gastrointestinal tumor suppressor locus at the 3p14.2 FRA3B site identified by homozygous deletions in tumor cell lines.Cancer Res，1996，56：978-983.

(收稿:1997-09-22修回:1997-12-31)

(校对:仵乾玉)