关键词： 反义核酸；融合基因，PML-RARα；白血病，早幼粒细胞性

摘要目的：研究PML-RARα融合基因的表达对NB4细胞生长分化作用的影响，探讨PML-RARα融合基因与急性早幼粒细胞白血病(APL)发病间的关系。方法：用反义核酸来封闭PML-RARα融合基因的表达并用RT-PCR的方法检测。NB4细胞的生长、分化及功能通过细胞生长曲线、形态学、细胞表面标志及NBT还原试验加以判定，细胞周期应用流式细胞仪进行分析。结果：反义硫代寡核苷酸(ASODN)通过封闭PML-RARα融合基因的表达能够降低S期细胞的百分率(56%降至37%)，继而抑制NB4细胞生长，促进NB4细胞的分化，提高其NBT还原率。结论：APL特征性的染色体易位t(15;17)形成的PML-RARα融合基因，与APL的发病有关。

Effect of antisense oligodeoxynucleotide (ASODN) to PML-RARα fusion gene on acute promyelocytic leukemia cell line NB4Yu Wenqiang,Sun Bingzhong, Chen Zhu.Department of Hematology, Xijing hospital, Xian 710032

Objective: To study the effect of PML-RARα expression on the proliferation and differentiation of NB4 cells, and explore the role of PML-RARα fusion gene in the pathogenesis of acute promyelocytic leukemia (APL).Methods:ASODN-mediated inactivation of PML-RARα mRNA was measured by RT-PCR. The proliferation and differentiation of NB4 cells were determined by proliferation curve, morphology, membrane CD antigen and NBT test. NB4 cell cycle was analyzed by FACS.Results: The inactivation of PML-RARα mRNA by ASODN decreased the percentage of S phase cells (from 56% to 37%), inhibited the NB4 cell proliferation and induced NB4 cells to differentiate to morphologically and functionally mature granulocytes.Conclusion: PML-RARα gene, as a molecular marker of APL, is possibly responsible for genesis of APL.

Key wordsAntisense oligodeoxynucleotideFusion gene, PML-RARαLeukemia, promyelocytic

急性早幼粒细胞白血病(APL)特征性的染色体易位t(15;17)形成的PML-RARα融合基因几乎存在于所有的APL细胞中，与APL的发病密切相关。如果能够有效地抑制或封闭PML-RARα基因的表达，就有可能影响APL细胞的生长分化。我们采用针对PML-RARα基因融合点的反义硫代寡核苷酸(ASODN)作用于带有特征性染色体t(15;17)的NB4细胞株，以观察对其生长分化的影响。

材料和方法

1反义核酸互补于PML-RARα基因(长型)融合点的全硫代修饰的18聚反义寡核苷酸片段及无义全硫代修饰的寡核酸片段NODN，序列分别为5′-TCTCAATGGCTGCCTCCC-3′和5′-CTGACAACGCAC-ATCTG-3′，由中国科学院上海细胞生物学研究所合成、纯化、分装，-20℃保存待用。NB4细胞株(急性早幼粒细胞白血病)为上海第二医科大学血液学研究所提供。HL-60细胞由本校免疫教研室提供。

2细胞培养NB4细胞和HL-60细胞采用含5%胎牛血清(60℃灭活1小时)的RPMI 1640液体培养，置37℃、5% CO₂、饱和湿度的恒温孵箱中培养，实验选用对数生长期细胞。每孔接种量为2ml，细胞浓度为5×10⁴/ml。分别加入终浓度为5，10，20，40，60μmol/L的ASODN，NODN终浓度为60μmol/L,空白对照加入相同量的培养液，每一种处理设4个复孔。培养18小时后再加入初始剂量一半的ASODN和NODN及空白培养液。每天从4个复孔中各取200μl进行细胞计数，取其平均数，台盼蓝拒染法判断细胞活性，绘制细胞生长曲线，计算细胞生长抑制率。NB4细胞为实验组，HL-60细胞为对照组。

3细胞生长状况检测细胞活性检测采用台盼蓝拒染法，根据细胞计数描绘生长曲线，计算生长抑制率。

4细胞分化状况检测

4.1细胞形态学检测：10⁴～10⁵细胞在离心涂片仪上涂片，自然晾干，瑞氏一步法染色后光镜下进行细胞形态学观察。

4.2细胞表面标志检测：CD_11b和CD₃₃抗原检测采用间接免疫荧光法，在荧光显微镜下观察，然后进行流式细胞仪检测。

5细胞功能检测采用NBT还原试验。NB4细胞和HL-60细胞用不同浓度的寡核苷酸处理，培养48小时和96小时后进行NBT还原反应。方法参照文献［1］。

6细胞周期动力学检测NB4细胞用不同浓度的寡核苷酸处理，培养96小时后，以正常人淋巴细胞的二倍体染色体作内对照，在流式细胞仪上进行细胞周期动力学分析。

7PML-RARα基因表达情况检测采用RT-PCR方法。具体操作参照文献［2］。

结果

1NB4细胞和HL-60细胞的低血清驯化为减少血清因素对ASODN作用的影响，我们对NB4细胞和HL-60细胞进行低血清驯化培养，NB4细胞的血清浓度由10%经7%，5%降至2%仍能很好地生长，倍增时间基本不变，血清浓度降到1%时，细胞生长明显抑制。HL-60细胞的血清浓度由10%经7%降到5%时，细胞生长良好，降到3%时，细胞生长抑制。为保证实验条件的一致性，我们确定实验中NB4细胞和HL-60细胞的血清浓度为5%。

2ASODN对NB4细胞和HL-60细胞增殖的影响当ASODN浓度大于20μmol/L时，NB4细胞出现生长抑制作用，随着ASODN浓度的增加及时间的延长，NB4细胞的生长抑制作用增强；NODN处理组和空白对照组的NB4细胞生长不受影响(图1)。三种处理方法对HL-60细胞的生长没有影响。

图1ASODN对NB4细胞增殖能力的影响

3ASODN对NB4细胞和HL-60细胞分化的影响ASODN(40μmol/L)对NB4细胞形态的影响主要表现为倒置显微镜下细胞大小不等，胞浆内颗粒增多。W-G染色可见细胞体积增大，核浆比例增高，胞浆颜色变浅，嗜天青颗粒减少，ASODN作用72小时后更为明显，可出现杆状核或肾型核细胞。用NODN处理和空白对照的NB4细胞形态学没有明显变化。细胞表面CD_11b、CD₃₃抗原采用流式细胞仪检测，正常NB4细胞CD_11b阳性率为0.5%，CD₃₃阳性率为70.4%，ASODN处理48小时后CD_11b阳性率升至2.4%，CD₃₃阳性率降为33.8%，96小时后，CD_11b阳性率升至15.8%，CD₃₃阳性率降为15.9%。其它处理组NB₄细胞及各处理组的HL-60细胞表面标志无明显变化。

4ASODN对NB4细胞和HL-60细胞功能的影响采用NBT还原试验以检测NB4细胞和HL-60细胞功能。ASODN(40μmol/L)作用48小时和96小时后NB4细胞的NBT还原能力明显提高，而对HL-60细胞没有影响(图2)。

5ASODN对NB4细胞周期的影响细胞周期分析表明ASODN能够明显降低S期细胞的百分率，当浓度为40μmol/L、作用96小时时空白对照组S期细胞为56%，NODN处理组为53%，ASODN处理组为37%。

图2ASODN对NB4细胞NBT反应的影响

6ASODN对NB4细胞PML-RARα基因表达的影响在体外采用异硫氰酸胍一步法提取不同处理组NB4细胞的RNA进行RT-PCR，其产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，发现ASODN作用8小时后，PML-RARα基因表达降低，表现为PML-RARα基因特异性扩增带荧光亮度变浅，48小时后特异性扩增带消失，此作用可持续至96小时。

1：0小时；2：8小时；3：48小时；4：96小时；

5：阴性对照；6：阳性对照

图3ASODN对NB4细胞PML-RARα基因表达的影响

讨论

PML-RARα基因是APL细胞的特异性标志，与APL的发病密切相关。反义技术作为基因“封条”能够特异地封闭或抑制其靶基因的表达，互补于靶基因不同位置的反义核酸其特异性和作用效率不同。要用反义核酸特异性地封闭一个融合基因，必须在其融合点附近设计反义核酸，从而才有可能避免反义核酸对细胞中的野生型基因造成影响。我们设计了一个互补于PML-RARα基因(L型)融合点上、下游各9个核苷酸的18mer反义寡核苷酸，计算机分析该序列与人类其它基因没有同源性。通过对ASODN进行硫代修饰，采用60℃、1小时灭活血清，同时降低培养细胞的血清浓度^［3］等方法提高了ASODN的作用效率。实验结果表明ASODN对NB4细胞PML-RARα基因表达的抑制具有特异性。

肿瘤的发生必须具备两个条件：一是细胞增殖旺盛或出现凋亡抑制，二是细胞出现分化障碍。在APL细胞中，PML基因能够