关键词： 多药耐药基因；定量逆转录-聚合酶链反应；白血病

摘要目的：构建定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的内标准DNA模板和RNA模板，定量检测多药耐药相关蛋白(MRP)基因表达的mRNA。方法和结果：利用现有的MRP全基因质粒和分子克隆技术经2次克隆将庚型肝炎病毒的一段238bp的核苷酸序列插入MRP292bp的目的cDNA片段，构建了插入突变型MRP-cDNA重组体作为定量PCR的DNA竞争模板；再经第3次克隆构建了插入突变型MRP-RNA重组体，最后经体外转录出530nt的正链RNA作为逆转录的RNA竞争模板。结论：所建立的RT-PCR技术简便、快速、灵敏，可检出1fg水平的mRNA量。用DNA竞争模板定量检测比用RNA竞争模板更简便、经济、可靠。

Construction of the internal standard RNA and DNA templates for MRP gene quantitative RT-PCR analysisCao liping^*,Wang Bin, Yu Zhifei.Department of Hematology, Liuhua Bridge Hospital, Guangzhou510010

AbstractObjective:To construct the internal standard RNA and DNA templates for quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and quantitatively measure the mRNA expression of MRP gene.Methods and Results: A 292bp fragment was amplified by PCR from plasmid pRC/RSV-MRP containing full-length mRP cDNA and inserted into the SmaⅠ site of PUC19 vector, constructing a recombinant plasmid-pUMRP292. A 238bp HGV fragment was amplified by PCR from plasmid pUHGV and inserted into the ClaⅠ site of pUMRP292, constructing a new recombinant plasmid-pUMRP 292/HGV as the internal DNA competitive template for quantitative pCR of MRP. A 530 fragment containing the 292bp of MRP and the 238bp of HGV was cut down by EcoRⅠ and XbaⅠ pUMRP292/HGV and cloned into the transcriptional vector pSP72 by the same enzyme sites, constructing a recombinant plasmid-pSMRP292/HGV, and then pSMRP292/HGV was cleaved with EcoRⅤ and transcripted in vitro by SP6 RNA polymerase, obtaining a 530bp mutant MRP-RNA positive strand as the internal RNA competitive template for quantitative RT-PCR.Conclusion: the established quantitative RT-PCR assay is simple, rapid and sensitive, and the DNA competitive template is more simple, economic and reliable than the RNA one.

Key wordsMultidrug resistance geneQuantitative reverse transcription-polymerase chain reactionLeukemia

人小细胞肺癌耐药细胞株H69/AR有多药耐药表型，但无p170糖蛋白过度表达。1992年Cole等^［1］从中克隆而来一个新的多药耐药相关蛋白(MRP)基因，该基因位于染色体16p13.1，cDNA全长6.5kb，编码由1531个氨基酸组成、分子量为19万的膜结合蛋白。已证明其耐药机制与p170糖蛋白相似。在多种人类肿瘤中该基因表达过高^［2］。我们经分子克隆和体外转录技术，构建了MRP内标准DNA和RNA竞争模板，建立了定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术，为定量检测MRP基因表达的mRNA提供了确实可行的简便手段。

材料和方法

1菌种和质粒pUC19载体购自华美生物工程公司，宿主菌JM109购自宝灵曼(BM)公司。庚型肝炎病毒cDNA/pUC18重组体(pUHGV)由中山医科大学分子医学研究中心吕凌教授惠赠。MRP重组质粒(pRC/RSV-MRP)由荷兰国立癌症研究所Borst教授惠赠。

2酶和试剂限制性内切酶、琼脂酶、逆转录酶、低熔点琼脂糖(LMA)均购自BM公司，Klenow酶和T₄ dNA连接酶购自BRL公司，MRP引物参考国外文献^［3］并经基因库检索更正，上游引物5′-GGACCTGGACTTCGTTCTCA-3′；下游引物3′-CGTCCAGACTTCTTCATCCG-5′，委托上海细胞生物学研究所合成。PCR试剂盒和pUC/M13通用引物购自Promega公司。

3DNA竞争模板的构建模式图见图1。

3.1PCR扩增MRP cDNA：以pRC/RSV-MRP质粒DNA为阳性模板，加入MRP特异性引物，参照PCR试剂盒说明书操作，循环条件为：变性93℃，30秒；退火55℃，30秒；延伸72℃，45秒；共循环25次，扩增片段为292bp(基因库登记号 l05628，4107～4399bp)，并用ABI PRISM^TM 310基因分析仪进行全自动测序。

3.2pUMRP292重组体的构建：将MRP PCR产物以Klenow酶修平末端，LMA回收292bp目的片段，插入pUC19质粒的SmaⅠ单切点，构建重组体pUMRP292。以碱法小量快速制备质粒DNA，分别用PvuⅡ、RsaⅠ、TaqⅠ等限制性内切酶酶切鉴定重组体，并用pUC/M13通用引物和MRP特异引物进行PCR鉴定，同时确定目的基因插入方向，最后全自动测序证实。

3.3pUMRP292/HGV重组体的构建(DNA竞争模板)：用庚型肝炎病毒特异性引物从pUHGV质粒扩增出238bp庚型肝炎病毒DNA片段，以Klenow酶修平末端，LMA回收后插入pUMRP292的ClaⅠ单切点，构建pUMRP292/HGV重组体，作PCR的DNA阳性竞争模板，由此扩增出的产物为530(292+238)bp。

4RNA竞争模板的构建

4.1pSMRP 292/HGV重组体的构建：以EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切pUMRP292/HGV,LMA回收530bp片段，经琼脂酶消化提取后，定向插入pSP72转录载体之EcoRⅠ和XbaⅠ切点，构建重组体pSMRP292/HGV,以MRP特异引物作PCR鉴定。

4.2制备MRP插入变异型RNA(RNA竞争模板)：以EcoRⅤ酶切pSMRP292/HGV，用SP6 rNA聚合酶转录出530nt的正链RNA，作为逆转录的RNA竞争模板。

5定量RT-PCR参数优化实验以插入突变型530bp rNA为阳性模板，经连续10倍稀释后进行RT-PCR，以确定RT-PCR反应的灵敏度、特异性和稳定性，并优化其下列各重要参数：AMV来源、批号和所需单位数、逆转录的最适温度和时间等；另外将不同稀释度的pUMRP292和pUMRP292/HGV质粒DNA作为模板，加入同一PCR反应管进行扩增，确定最佳竞争模板量和检测灵敏度。

图1MRP RNA和DNA构建模式图

6患者MRP基因mRNA定量检测用异硫氰酸胍一步法抽提白血病患者骨髓单个核细胞总RNA^［4］进行逆转录和PCR扩增，琼脂糖电泳观察结果。阳性标本可用两种方法定量：①以RNA竞争模板定量：将阳性标本总RNA作系列稀释，每管同时加入相同量RNA竞争模板，进行RT-PCR反应。②以DNA竞争模板定量：将阳性标本的逆转录产物作系列稀释，每管同时加入相同量DNA竞争模板，进行PCR反应。取PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果，若292bp扩增带与竞争模板530bp扩增带亮度相同，说明两者的mRNA量相等。亦能通过对292bp和530bp扩增带的扫描，更客观地计算待检mRNA量。因加入的竞争模板量是已知的，从而可参比出标本中mRNA量。

结果

1PCR产物测序用MRP特异性引物测序结果表明，扩增的PCR产物确为MRP基因4107～4399bp片段，与基因库检索的MRP基因碱基序列完全相符。

2pUMRP292重组体及其插入方向鉴定①通用引物PCR鉴定：pUC/M13通用上游引物R(Reverse)序列为AACAGCTATCACCATG；下游引物F(Forward)为CAGCACTGACCCTTTTG，两引物至MRP插入位点SmaⅠ的距离分别为62和56bp。以MRP特异引物P₁和P₂分别与通用引物R和F配对进行PCR扩增（结果见图2），与理论推测的正向插入完全相符。②限制性内切酶鉴定pUMRP292重组体：pUMRP292分别用限制性内切酶BgⅡ、PvuⅡ、RsaⅠ、TaqⅠ、ClaⅠ+PstⅠ酶切后的电泳图谱见图3，其与用DNASIS软件分析的pUMRP292正向插入的酶切图谱完全相符。③全自动测序证实MRP292bp片段正向插入pUC19的SmaⅠ位点。

1：UR+MRP P₂；2：UR+MRP P₁；

3：UF+MRP P₂；4：UF+MRP P₁；

M：Marker pBR322/HinfⅠ

图2pUMRP292插入方向的PCR鉴定图谱

3定量RT-PCR优化实验将pUMRP292质粒DNA系列稀释后作模板，每管加入相同量的pUMRP292/HGV质粒DNA作为竞争模板，竞争PCR结果可见明显的竞争梯度，随着292bp模板稀释度的增加，其292bp产物量递减，而530bp产物量递增，在第3管两者亮度相同，说明此时292bp靶模板和530bp竞争模板量相等(图4)。

1：BgⅡ(1860，1118)；2：PvuⅡ(2364,614);

3：RsaⅠ(2034,676,241,27);4:ClaⅠ+PstⅠ(2810,168)；