关键词： 基因，bcl-2；基因，Fas；细胞凋亡；淋巴瘤

摘要目的：通过bcl-2阻断Fas介导的细胞凋亡了解bcl-2基因在淋巴瘤癌变过程中逃避机体免疫监控的作用机制。方法：应用基因重组技术重组pLXSN-bcl-2，采用电穿孔法将其与空载体分别转染包装细胞系PA317，将阳性克隆病毒上清感染人T淋巴瘤细胞株Jurkat，用G418筛选，其阳性克隆进行免疫组化检测，应用抗Fas抗体诱导细胞凋亡来模拟细胞毒T细胞的杀伤机制，观察bcl-2在淋巴瘤逃避免疫机制中的作用。结果：转染人bcl-2基因的Jurkat(Jurkat-bcl-2)细胞较对照Jurkat及转染空载体Jurkat (Jurkat-neo)细胞，bcl-2表达量明显增加，而Fas基因表达量无明显变化。其Jurkat-bcl-2能明显耐受抗Fas抗体诱导的细胞凋亡。结论：人bcl-2基因在淋巴瘤中过量表达，能部分阻断抗Fas抗体诱导的细胞凋亡，bcl-2基因过量表达可能是淋巴瘤癌变过程中逃脱机体免疫监控的机制之一。

Fas mediated apoptosis inhibited by human bcl-2 gene in lymphoma cell line JurkatCao huifang， Qian Qijun， Wu mengchao,et al. Tumor Immunology and Gene Therapy Center, The Eastern Institute of Hepatobiliary Surgery, Shanghai200433

AbstractObjective： to understand the mechanism of bcl-2 gene in escaping the immune surveillance in the development of lymphoma.Methods:A recombinant retroviral vector pLXSN-bcl-2 was constructed by cloning bcl-2 cDNA into the replication defective retroviral vector pLXSN, and transferred to packaging cell line PA317 by electroporation. The G418 resistant colonies were selected, and the supernatants of the colony cultures were used to infect the human lymphoma cell line Jurkat. Cells in G418 resistant Jurkat colonies were characterized by immunohistochemistry. Anti-Fas monoclonal antibody (McAb) was applied to Jurkat cells for inducing apoptosis which mimicked the cytotoxic activity of T lymphocyte.Results: expression of bcl-2 in pLXSN-bcl-2 transfected Jurkat cell (Jurkat-bcl-2) increased, while there was no change of Fas gene expression. Apoptosis was blocked in Jurkat-bcl-2 by anti-Fas McAb treatment.Conclusion:Overexpression of bcl-2 in lymphoma cell line could inhibit cell apoptosis induced by anti Fas mcAb, suggesting that overexpression of bcl-2 is one of the mechanisms in escaping immune surveillance in the development of lymphoma.

Key wordsGene, bcl-2 Gene, FasApoptosisLymphoma

免疫系统清除肿瘤细胞主要通过细胞毒性T淋巴细胞(CTL)诱导肿瘤细胞凋亡。T细胞对肿瘤的杀伤主要通过穿孔素途径及Fas-配体(Fas-L)途径。T细胞表达的Fas-L可与肿瘤细胞Fas结合，直接导致肿瘤细胞凋亡^［1,2］。bcl-2基因表达产物具有抗凋亡的功能，最近有研究表明bcl-2基因具有拮抗CTL对肿瘤的杀伤活性^［3］。然而对bcl-2拮抗CTL的杀伤活性的分子机制尚不明确，为此，我们应用基因转染技术将bcl-2转入淋巴瘤细胞系Jurkat，应用抗Fas单克隆抗体(单抗)模拟Fas-L，来研究bcl-2对Fas-L诱导肿瘤细胞凋亡途径的影响。

材料和方法

1材料Jurkat及PA317细胞系、逆转录病毒载体pLXSN均为本中心常规保存，人bcl-2 cDNA由美国Stanford大学医学院Cleary博士惠赠，鼠抗人Fas单抗(CH11)由日本Osaka研究所Nagata博士惠赠，鼠抗人bcl-2单抗由美国John radcliffe医院Mason博士惠赠，放线菌素D购于美国Sigma公司，兔抗Fas系统购于美国Santa cruz生物技术公司。

2逆转录病毒载体pLXSN-bcl-2的构建人bcl-2基因cDNA全长为850bp，应用EcoRⅠ+XhoⅠ双酶切，回收850bp片段，将其片段插入逆转录病毒载体pLXSN的多克隆位点EcoRⅠ和XhoⅠ。粘端连接反应、小样鉴定及质粒提取参见常规方法。

3逆转录病毒载体转染PA317细胞系及Jurkat细胞系采用电穿孔法，将重组的逆转录病毒载体转染PA317，应用300μg/ml g418进行筛选，共筛选4周。取病毒上清0.5ml，过滤，加入Jurkat细胞内，再加1∶100稀释聚凝胺(8μg/ml)，在37℃孵育4小时，然后洗涤，加入含15%胎牛血清的RPMI1640，48小时后加入G418 1000μg/ml，培养4周，然后进行极度稀释法单克隆化。

4免疫组织化学参照ABC方法。

5Fas单抗诱导Jurkat细胞凋亡及梯状DNA形成Fas单抗0.1μg及50ng/ml放线菌素D，加入细胞1×10⁶/ml，在二氧化碳孵箱培养5小时后进行梯状DNA电泳。取1×10⁶/ml细胞，离心，2000r/min×5分钟，弃上清，用PBS洗2次，加20μl溶解缓冲液［50mmol/L tris-HCl pH7.8，10mmol/L EDTA Na，0.5% 十二烷基肌氨酸钠(Sodium-N-lauroylasarcosinate)］，RNA酶(10mg/ml)1μl混匀，50℃，30分钟后加入蛋白酶K(10mg/ml)1μl，50℃，60分钟，加载样液，在1%琼脂糖中电泳。

6³H掺入法取生长良好细胞置96孔板，每孔5×10³个细胞，分别加入0.02,0.05,0.1,0.2,0.5μg/ml fas单抗(CH11)及50ng/ml放线菌素D，加入含15%胎牛血清的RPMI 1640至0.1ml，每个浓度组设平行对照3个，每个实验重复3次，在二氧化碳孵箱(5%CO₂、37℃)中培养48小时，加入RPMI1640［含37kBq³H TdR(比放射性为1.369×10⁹kBq*mmol^－1*L^－1)、15%胎牛血清］100μl，孵育6小时，用多头收集器将细胞收集于玻璃纤维纸上，70℃烘干，将玻璃纤维纸放在1ml闪烁液中测定每分钟放射性核素计数(c/min)。

7统计学分析各曲线之间采用双因素方差分析。

结果

1逆转录病毒载体pLXSN-bcl-2的构建人bcl-2基因全长为850bp，应用EcoRⅠ+XhoⅠ双酶切，酶切片段为850bp，插入逆转录病毒载体pLXSN的多克隆位点，经EcoRⅠ+XhoⅠ酶切，电泳带850bp与5874bp，经HindⅢ酶切后电泳带约350bp与6200bp，证实pLXSN-bcl-2正向连接(见图1)。

图1重组逆转录病毒载体pLXSN-bcl-2构建图

2pLXSN-bcl-2及pLXSN转染PA317及逆转录病毒上清转染Jurkat细胞系、克隆化及鉴定采用电穿孔法将上述两载体分别转入PA317，经300μg/ml g418进行筛选，加药1周后，大部分细胞死亡，2周后可见形成克隆，各克隆用G418维持扩增，共用G418筛选4周。将其上清转染Jurkat细胞，G418100μg/ml培养4周，然后进行极度稀释法单克隆化，分别命名为Jurkat-bcl-2、Jurkat-neo，应用免疫组化方法进行鉴定，结果表明Jurkat-bcl-2与Jurkat、Jurkat-neo相比，其bcl-2表达量增加，而Fas表达量无明显变化。

3抗Fas单抗诱导Jurkat、Jurkat-neo及Jurkat-bcl-2细胞增殖及凋亡情况应用³H掺入法观察了不同浓度抗Fas单抗加50ng/ml放线菌素D对上述3种细胞系增殖的影响，结果Jurkat与Jurkat-neo基本相似(P＞0.05)，而Jurkat-bcl-2生存率明显增加(P＜0.01)(见图2)。用0.1μg抗Fas单抗+50ng/ml放线菌素D诱导Jurkat、Jurkat-neo及Jurkat-bcl-2细胞凋亡，结果表明Jurkat及Jurkat-neo均可诱导出明显梯状DNA，而Jurkat-bcl-2则无明显梯状DNA形成，这一结果表明bcl-2能明显阻断抗Fas单抗诱导的细胞凋亡(见图3)。

图2抗Fas单抗对Jurkat、Jurkat-neo及Jurkat-bcl-2

细胞增殖的影响

M：PGEM-7zf/Hae Ⅲ分子标记；1：Jurkat;

2:Jurkat-neo;3:Jurkat-bcl-2

图3抗Fas单抗诱导3种细胞的DNA电泳图

讨论

人bcl-2基因定位于18号染色体，但在某些B细胞淋巴瘤患者易位至第14号染色体，与免疫球蛋白重链位点接起来，形成融合基因，易位后的bcl-2基因所编码的蛋白质结构不变，但表达量大大增加，可能与免疫球蛋白重链基因增强子有关，Bcl-2蛋白在B细胞淋巴瘤癌变机制中作用仍不十分清楚，通常认为与其抗凋亡功能有关。最近有研究表明过量bcl-2基因表达能拮抗部分CTL的杀伤^［3］。现已知CTL对肿瘤的细胞杀伤主要通过穿孔素及Fas-L两个途径^［1,2］，为此我们应用抗Fas单抗模拟Fas-L的杀伤作用，应用基因转染技术将bcl-2基因转染Jurkat细胞，其过量表达Bcl-2能明显阻断Fas单抗介导的细胞凋亡，这表明bcl-2基因在淋巴瘤中过量表达，能够阻断Fas-L与Fas结合导致的肿瘤细胞凋亡，使CTL对肿瘤的杀伤能力大大减弱，这可能是淋巴瘤逃脱机体免疫监控的机制之一。

参 考 文 献

1Kagi d, Vignaux F, Ledermann B, et<