关键词： 遗传性高铁血红蛋白血症；细胞色素b5还原酶；聚合酶链反应；基因突变

摘要 目的：鉴定导致中国人遗传性高铁血红蛋白血症(RCM)的NADH-细胞色素b5还原酶(b5R)基因突变类型，探讨RCM发病的分子基础。方法：逆转录-聚合酶链反应产物直接测序和cDNA克隆测序分析先证者的b5R编码基因；限制性酶切分析其基因组DNA。结果：发现一例RCM患者b5R基因第72密码子存在新的错义突变(CTC→CCC)。结论：该突变导致b5R蛋白第72位亮氨酸被脯氨酸替换(L72P)是该先证者致病的分子基础；进一步证实Ⅰ型RCM患者的b5R基因突变多发生在近5′端部分。

Leu 72 Pro mutation in the NADH-cytochrome b5 reductase gene found in a

chinese hereditary methemoglobinemia patient Wu Yushui, Huang changhui,

zhu Zhongyong, et al.Center for Medical Laboratory, Fuzhou Military General

hospital, Fuzhou 350001

Abstract Objective: To characterize the mutation in NADH-cytochrome b5

reductase gene in a Chinese hereditary methemoglobinemia patient, and elucidate

the molecular basis of the disease.Methods: b5R gene from a propositus was

analyzed by sequencing the RT-PCR products as well as cDNA clones; and the results

were further confirmed by restriction enzyme analysis of the genomic DNA fragments.

Results: A novel mutation was found at codon 72 of b5R gene from the propositus.

Conclusion: Replacement of Leu with Pro at codon 72 of b5R gene is the molecular

basis of the propositus; and the mutant allele located in 5′ part of b5R gene

mainly cause hereditary methemoglobinemia type I.

Key words Hereditary methemoglobinemiaCytochrome b5 reductasePolymerase

chain reactionGene mutation

人NADH-细胞色素b5还原酶(b5R)基因长31kb,含9个外显子和8个内含子；cDNA长1974bp^［1,2］。寻找和分析b5R的基因突变类型，有助于研究该酶结构与功能的关系，从基因水平探究常染色体隐性遗传性高铁血红蛋白血症(RCM)的发病机制，并为建立RCM基因诊断方法检测人群中的杂合子携带者、遗传咨询和优生优育乃至基因治疗等提供必要条件。我们用聚合酶链反应(PCR)相关技术及分子克隆和序列测定，分析福州市郊县一RCM家系先证者的

b5R基因，发现了一个新的错义突变。

病例和方法

1 先证者 女，3岁。足月产，发育正常。父母非近亲婚配。出生后数月发现患儿颜面部发绀，尤以口唇为甚，无明显诱因。其兄(5岁)亦有类似症状。无活动后蹲踞现象。超声心动图和心肺各项检查未见异常。精神神经系统检查未见异常。血气分析示低氧血症。Hegesh改良法检测b5R活性为0.10U(正常对照2.30±0.31U)；高铁血红蛋白含量占全部血红蛋白的15%。血红蛋白分析未见异常。临床诊断：遗传性高铁血红蛋白血症Ⅰ型。入院后给予维生素

c治疗，全身发绀明显减轻。

2 主要试剂与仪器 RNA提取试剂盒及DNA测序试剂盒(Promage公司产品)；反转录试剂盒(Gibco公司产品)，Taq酶(Sangon公司产品),γ-³²P-ATP(北京亚辉生物工程公司产品)，内切酶EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ、Apa Ⅰ和DNA分子量参照物购自华美公司；T₄ dNA连接酶购自NewEngland Biolab公司。PE2400 DNA扩增仪、荧光自动DNA序列分析仪(美国PE公司产品)、手工测序装置(Bio-Rad公司产品)。

3 方法

3.1 逆转录半巢式PCR：外周血白细胞总RNA的提取和cDNA第一链的合成按各自试剂盒说明书进行。自行设计扩增b5R cDNA全部编码序列(900bp)的外引物(由Sangon公司合成)：P₁(上游)

5′GGGAATTCATGGGGGACCCAGCTCAGCACG3′

p₂(下游)

5′GGGGATCCCCTCAGAAGACGAAGCAGCGC3′内引物：

P₃(下游)5′GATGACCAGGTCCACGAAAGC3′

P₄(上游)5′GAGAATTCGAGAGCCCGGACATCAAG3′以逆转录合成的cDNA (1.0μl)为模板，先用外引物P₁/P₂(各15 pmol)、5.0mmol dNTP、

2.5μl10×PCR缓冲液、1UTaq聚合酶在25μl反应体积中作PCR扩增；反应结束后，取1.0μl产物分别用引物P₁/P₃和P₂/P₄行半巢式PCR的第二轮扩增。两轮循环反应条件均为：94℃30秒，60℃30秒，72℃45秒，共30个循环。最终反应产物经普通琼脂糖凝胶电泳纯化回收。3.2 PCR产物直接测序：P₁和P₃末端标记γ-³²P-ATP后，分别作测序引物，对P₁/P₃半巢式扩增产物进行手工测序(按说明书操作)。

3.3 PCR产物克隆测序：纯化回收后的引物P₂/P₄半巢式PCR扩增产物及噬菌体载体M13mp18分别用EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切，用连接酶连接过夜(16℃)。常规氯化钙法转化大肠杆菌JM109。重组子鉴定、单链抽提等按文献［３］方法。以正常人及先证者部分b5RcDNA阳性克隆的噬菌体单链为模板，荧光标记的M13通用引物进行全自动DNA序列分析。

3.4 基因组DNA片段的扩增及限制性酶切分析：为进一步证实该突变的存在并建立简便的基因诊断方法，常规方法提取患儿及正常人外周血白细胞基因组DNA。扩增b5R第3、第4外显子的引物序列及扩增条件参见文献［4］。PCR产物经乙醇沉淀、洗涤后用ApaⅠ酶切，8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

结果

1 PCR产物直接测序 P₁/P₃半巢式扩增产物(长338bp)测序结果显示，与正常人比较，先证患儿b5R第72密码子(位于外显子3)以脯氨酸(CCC)替换了正常的亮氨酸(CTC)(见图1)。

与正常人b5R编码基因比较,先证者基因的第72位密码子的改变为CTC→CCC(结果所示为编码链)

图1 b5R cDNA部分序列分析结果

2 PCR产物克隆测序 P₂/P₄半巢式扩增产物(长817bp)克隆后的测序结果证实，与正常人b5R cDNA序列(结果未显示)比较，先证患儿b5R基因第72密码子存在CTC→CCC突变，而第4外显子以及下游序列未见其它突变(见图2)。

先证者基因的第72位密码子改变为CTC→CCC(结果所示为反义链)

图2 先证者b5R cDNA经半巢式PCR扩增的产物克隆后全自动序列分析结果

3 限制性酶切分析 用引物P₅/P₆扩增出长1120bp的基因组DNA片段。由于第72密码子突变后导致该位点产生一个Apa Ⅰ酶切位点(5′GGGCC↓C3′),使酶切片段改变(见图3)。正常为471，649bp；先证患儿为440，31，649bp。确证先证患儿b5R基因存在新的突变(CTC→CCC)。

a：正常对照；B：先证患儿；M：分子量标记

图3 限制性酶切分析b5R基因组DNA的PCR扩增片段

讨 论

已报道的Ⅰ型RCM的b5R基因突变均为发生在外显子的错义突变^［5］。所以，我们以细胞总RNA经逆转录合成cDNA，以此为模板进行PCR扩增及序列分析，可迅速有效地检出编码基因的突变。

迄今已发现13种不同的突变位点可导致Ⅰ型和Ⅱ型RCM。国内仅我们报道过一种与日本学者报道相同的突变类型^［６］。RCM Ⅰ型患者b5R缺陷仅见于红细胞，临床表现较轻，以全身发绀为主。Ⅱ型患者全身细胞均存在b5R缺陷；临床表现除发绀外，还有致死性的精神发育迟缓及神经系统紊乱等^［７］。寻找和分析b5R的基因突变类型，有助于揭示单一基因发生的突变引起不同临床表型的分子机制。从目前的研究结果看，Ⅰ型RCM患者的b5R基因突变位点大多近基因的5′端(仅1例例外)，而Ⅱ型患者该基因突变位点大多近3′端。前者导致突变酶的稳定性降低；后者往往导致突变酶的稳定性和催化活性都大大降低^［５］。我们的研究结果也证实了这一结论。经对正常人和患儿的b5R基因这一位点碱基序列的反复测定及限制性酶切分析，排除正常多态性和PCR错配的可能性，确证了患儿b5R