真性红细胞增多症(真红)系克隆性造血干细胞疾病^[1]，病因和发病机制不明。真红患者的骨髓可在不加入红细胞生成素(Epo)的体外培养条件下培养出红细胞集落，对产生这种集落的解释，一种认为是真红对Epo高度敏感^[2]，另一解释是这种集落不依赖Epo^[3]。随着实验技术的改进，尤其是用无血清的培养条件，人们更倾向于认为内生性红细胞集落不依赖Epo生长。我们对真红患者和正常人培养得到的同期红系祖细胞(CFU-E)Epo受体(EpoR)的表达进行了检测。

材料和方法

1 血标本来源 5例均为在北京协和医院就诊的真红患者，男性3例，女性2例，平均年龄56岁。按照文献［4］标准诊断。正常对照为同期的正常献血员。

2 将新鲜、抗凝外周血经两阶段液体培养^[5]：第一阶段将单个核细胞以(1～2)×10^６/ml的细胞浓度加入IMDM(Gibco-BRL)中，内含20%胎牛血清(中国医学科学院血液学研究所生产)、1000U/ml iL-3(Kirin公司惠赠)、1μg/ml环孢霉素A(CsA)(Sandos公司产品)、1.5mmol/L谷氨酰胺(Sigma公司产品)。在37℃、5% cO_２条件下培养6天后，取出不贴壁细胞，转入第二阶段，以5×10^５/ml的细胞浓度加入IMDM中，内含30%胎牛血清、1%牛血清白蛋白(Sigma公司产品)、10^－５mol/L2-巯基乙醇(Sigma公司产品)、1.5mmol/L谷氨酰胺、10^－６mol/L地塞米松(上海第九制药厂生产)、1μg/ml csA、2U/ml Epo(Amgen公司产品)，在37℃、5% CO_２条件下培养。在第二阶段培养至第4天时，将细胞取出，离心后分离出上清，以4~5ml iMDM重新悬浮细胞，铺于2ml 45% Percoll(Sigma公司产品)上，2000r/min离心20分钟。

3 Northern blot

3.1 取出位于Percoll界面层的细胞，用PBS洗2次后，采用异硫氰酸胍一步法提取RNA，RNA的电泳及转膜依Dupont公司的说明书进行。将总RNA变性后行甲醛变性胶电泳，然后转至尼龙膜(Dupont公司产品)。

3.2 含EpoR DNA pGL2质粒(美国国立卫生研究院Nugochi博士惠赠)经Xho i和Hind Ⅲ酶切后，低熔点胶回收、纯化DNA探针。EpoR探针包含编码EpoR基因5′端序列的150bp和上游序列150bp，共300bp。

3.3 探针的Dig标记和Northern blot均依Boethringer Mannheim公司的试剂盒说明书操作。经高含量SDS预杂交液预杂交8小时后，更换杂交袋和新的高含量SDS预杂交液，加热变性后检测标记效果满意的EpoR和β-actin探针，杂交过夜。免疫检测(显色)。

结果

5例真红患者，其红细胞数为 (7.58±0.95)×10¹²/L，血红蛋白为209.4±22.9g/L，均明显高于正常；白细胞数为(11.76±4.64)×10^９／L，也高于正常；血小板在正常范围。红细胞容量为59.48±16.43ml/kg(本院正常值：男性31.6±3.5ml/kg；女性23.7±1.6ml/kg)，血容量为104.84±20.51ml/kg(本院正常值：男性69.1ml/kg；女性83.1ml/kg)，均明显高于正常。血清Epo水平为7.2±3.5U/L，属正常范围(本院正常值7.0±1.1U/L)。血氧饱和度为95%±2%。均已除外缺氧等能引起继发性红细胞增多症的因素。

经我们建立的外周血早期红细胞的分离方法可使CFU-E占细胞总数的30%以上，若取血量在200ml以上，每次实验中CFU-E总数均能达到10^５以上，可保证Northern blot的进行。取出第二阶段加Epo培养后第4天(CFU-E的生长达高峰)的细胞提取总RNA，经分光光度仪测定，A(吸光度，曾称光密度OD)₂₆₀/A₂₈₀＞2.0。将5例真红患者和对照组的等量总RNA进行变性胶电泳(附图a)，然后转至尼龙膜。

包含EpoR DNA的pGL2质粒，经酶切和低熔点胶回收后，获得EpoR dNA片段，测得A_26０/A₂₈₀＞1.8。作为EpoR探针。用随机引物法标记Dig，在行Nothern blot前，将标记后的探针显色与试剂盒的对照相比，显示标记良好(10μg/ml)，达到试剂盒要求。

以EpoR DNA和β-actin作探针，对5例真红患者和正常对照的总RNA行Northern blot(附图b)，比较杂交后不同泳道显示的条带位置无显著差异。与内对照β-actin(附图c)相比不同泳道间mRNA的量也相差不大。这提示真红患者和正常人培养到同期的CFU-E，其EpoR的表达无明显差异。

pV为真红患者；N为正常对照

各泳道的EpoR的条带位置相同(b)，与β-actin(c)相比，

各泳道显色无明显差异，即EpoR mRNA的量无明显差异

附图a总RNA在变性胶电泳时紫外透射的照片

b以Epo DNA为探针Northern blot结果

c以β-actin为探针Northern blot结果

讨论

EpoR的表达从BFU-E到CFU-E呈逐渐增多，到CFU-E达到高峰，以后逐渐下降。为比较真红和正常人EpoR表达的差异，获得一定的CFU-E是前提。通过两阶段液体培养方法^[5]，我们可以获得一定量的早期红细胞，该期细胞经甲基纤维素半固体培养证实为发展至CFU-E的红系细胞，可达细胞总数的30%以上。我们对真红患者和正常对照所做的研究是在相同培养条件和培养时间的细胞EpoR基因表达，加之EpoR基因的表达有组织特异性，即使有非红系细胞存在，但这些细胞没有或很少有EpoR基因的表达，所以用本研究的培养方法比较真红与正常人的EpoR基因表达结果应是可信的。

我们的实验结果显示，真红患者和正常人CFU-E EpoR表达无差异。由于我们采用的EpoR探针只包含编码EpoR基因5′端序列的150bp和上游序列150bp，所含序列不够长，如有点突变，可能会难以发现。另外，仅仅测定EpoR的表达有无异常尚不足以说明EpoR无异常，因为从基因转录到蛋白质生成涉及多个环节。我们仅从EpoR mRNA的大小及多少证明真红和正常人无差异，只能说是个极初步的线索。

有人对细胞表面EpoR进行测定，提示真红的发病并非因EpoR的数目和亲和力变化所致^[6]。另有一项研究通过RT-SSCP和DNA-SSCP分析，分别对EpoR cDNA和EpoR启动子区域分析，未发现点突变，对整个编码Epo基因区域的PCR产物进行测序，未发现有异常^［７］，进一步证实了真红的EpoR基因无异常。

综合我们的实验结果和国外的研究，可以认为真红的发病可能不在EpoR这一环节。

本课题受国家教委博士生重点项目基金(93071)资助

参 考 文 献

1 Adamson JW, Fialkow PJ, Murrhy S, et al. Polycythemia vera: stem cell and probable

clonal origin of the disease. N Engl J Med, 1976, 295：913-916.

2 Casadevali N, Vainchenker CL, Lacombe G, et al. Erythroid progenitors in

polycythemia vera: demonstration of their hypersensitivity to erythropoietin

using serum free cultures. Blood, 1982, 59:447-451.

3 Fisher MJ, Prchal JF, Prchal JT, et al. Anti-erythropoietin (EPO) receptor

monoclonal antibodies distinguish EPO-dependent and EPO-independent erythroid

progenitors in polycythemia vera. Blood, 1994, 84:1982-1991.

4 张之南主编. 血液病诊断及疗效标准. 第1版.天津：天津科学技术出版社，1991. 128.

5 Fibach E, Manor D, Oppenbeim A. Proliferation and maturation of human erythroid

progenitors in liquid culture. Blood, 1989, 73:100-104.

6 Broudy VC, Lin N, Papayannopoulou TH, et al. Erythropoietin receptor in

polycythemia vera. Exp Hematol, 1990, 18:576.

7 Hess G, Rose P, Gamm H, et al. Molecular analysis of the erythropoietin receptor

system in patients with polycythaemia vera. Br J Haematol, 1994, 88:794-802.

收稿：1997-04-10 修回：1997-10-24校对：徐丽娟