我们介绍运用聚合酶链反应(PCR)结合限制性内切酶TaqⅠ酶切分析方法研究凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因热点突变，首次在国内发现1例血友病A基因热点突变，现报道如下。

病例和方法

1 病例资料 患者，男，3岁。平时有鼻衄、撞后出血不止等症状。1年前因唇外伤后出血不止来我院诊治。家族中无类似病病史。主要实验室检查：CT10分钟，BT 6.5分钟，KPTT 93.2秒，FⅧ∶C 2%(一期法)，FⅧ∶Ag?%(放免法)。

2 基因组DNA抽提 按本室常规抽提外周血白细胞基因组DNA。

3 聚合酶链反应(PCR)

3.1 引物：用于PCR扩增FⅧ基因24号外显子的引物序列为：

pA7:5′-TTGAGGTTGCAGCATGCCAT-3′

pA8:5′-CTGAGGTCTCCAGGCATTAC-3′以上引物由法国巴黎Bicetre医院Meyer教授惠赠。

3.2 PCR：反应体积50μl，DNA 0.5μg，引物各25 pmol，dNTP 50mol/L，1.5mmol/LMgCl_２,10mmol/L tris-Cl(pH 8.3), 50mmol/L KCl, 0.1% Triton X-100, Taq DNA聚合酶1.5U(Sangon公司产品)。扩增条件：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，74℃延伸30秒，共35个循环，最后74℃延伸7分钟。取10μl上述PCR扩增产物作1.5%琼脂糖电泳，检查是否扩增出特异性条带。

3.3 PCR产物酶切分析：见文献[1]，PCR扩增产物经氯仿-异戊醇(24∶1)抽提，取20μl以限制性内切酶TaqⅠ(Boehringer-Mannheim公司)10U，65℃酶切过夜。酶切产物作8%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，1×TBE，电压120V，电泳3小时。电泳后置0.5%溴乙锭染色30分钟，置紫外灯下观察酶切图谱。

4 PCR扩增产物的克隆 PCR扩增产物经补平、磷酸化，1.2%琼脂糖电泳纯化后，与克隆载体pUC18(经SmaⅠ酶切)在T_４ dNA连接酶作用下连接，连接物常规转化大肠杆菌TG1，并在涂有X-gal和IPTG的LB平皿中接种，挑取白色菌落扩增，抽取质粒DNA，然后由EcoRⅠ、HindⅢ双酶切鉴定。

5 DNA序列分析 采用Sanger双脱氧链终止法，按T_７ squencing^ＴＭ试剂盒使用说明操作，［α-^３２P］ dATP标记，6%变性聚丙烯酰胺凝胶，厚度为0.4mm，胶长50cm，电泳在Pharmacia lKB公司的Macrophor测序仪上进行，电压1500V，时间3～6小时。测序胶置X线片曝光，室温过夜，放射自显影。

结果

1 热点突变的酶切分析 为研究血友病A患者热点突变的情况，我们采用了5对引物分别扩增FⅧ基因18，22～24和26号外显子，扩增产物经8%PAGE，紫外灯下观察酶切图谱，发现1例异常(图1)。从图1可看出，患者FⅧ基因24号外显子经TaqⅠ酶切后，仅出现1条带，即丧失TaqⅠ酶切位点。而正常者则出现2条带，即存在TaqⅠ酶切位点。

m为DNA Marker：pBR322/Hae Ⅲ；1为未经酶切的PCR产物；2为患者；3为其母；4为其父；5，6为正常对照

图1 血友病A FⅧ基因外显子24 Taq Ⅰ酶切分析结果

2 DNA序列分析对于酶解图谱异常的标本通过双脱氧链终止法进行测序分析，发现患者FⅧ基因24号外显子在2209位密码子发生无义点突变，即CGA→TGA，导致精氨酸(Arg)变为终止密码子(见图2)。

3 家系分析 患者母亲的酶解图谱呈现丧失/存在TaqⅠ酶切位点的杂合子状态，提示患者FⅧ的点突变由其母亲遗传获得。

图2 患者FⅧ基因第24号外显子DNA序列分析结果，发生了C→T点突变

讨论

FⅧ基因DNA链上胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T)，形成一个终止密码子(TGA)，使FⅧ肽链合成提前终止，合成较短的没有功能的FⅧ。这通常与血友病A重型表型相关^[2]。这种突变发生于CG双核苷酸。C→T突变是基因突变的“热点”，其原理是胞嘧啶甲基化形成的5-甲基胞嘧啶自动经过脱氨作用形成胸腺嘧啶，结果引起DNA碱基C→T突变。由于FⅧ基因及其cDNA较长，血友病A的发病机制相当复杂。在已发现的300多种基因缺陷中，点突变占174个(57%)，尤其是轻、中型患者，点突变是主要的发病机制，其中热点突变占25%^［3］。在FⅧ cDNA中，共有7个TaqⅠ酶切位点，其中5个为CGA密码子编码精氨酸(Arg)^［４］。如果发生C→T突变，即导致终止密码子的产生，它们分别位于外显子18，22，23，24和26号。最初血友病A患者的基因突变就是利用Southern印迹技术结合TaqⅠ酶切发现的^{［５～７］}。为此我们应用PCR结合TaqⅠ酶切分析了72个血友病A病例FⅧ基因这5个外显子TaqⅠ酶切位点的基因突变情况，结果发现1例异常，在24号外显子处丧失1个TaqⅠ酶切位点。经克隆测序证实，该患者FⅧ基因24号外显子2209位密码子发生突变，即CGA→TGA，使精氨酸变成终止密码子。据国外文献报道，发生在TaqⅠ位点的基因突变频率大约占所有血友病A患者的3%～6%^{［１，６，８］}，而我们的频率约为1.4%，这种差异还有待于扩大研究样本来进一步证实。

国外已报道的该位点突变的24例血友病A患者中12例为精氨酸突变为谷氨酰胺，10例为精氨酸突变为终止密码子，而且绝大多数为重型病例^［３］。运用PCR扩增包含TaqⅠ酶切位点(识别CG序列)区域，这对于血友病A基因缺陷的快速筛选不失为一种有效的定位方法。反过来，这些位点的突变也为CG双核苷酸热点突变提供了佐证。FⅧ基因热点突变的研究，不仅有助于了解这些位点的基因突变频率，而且也有利于开展快速的遗传咨询工作。

参 考 文 献

1 Lavergne JM, Bahnak BR, Vidaud M, et al. A directed search for mutations in

hemophilia A using restriction enzyme analysis and denaturing gradient gel

electrophoresis: a study of seven exons in the factor Ⅷ gene of 170 cases.

Nouv Rev Fr Hematol, 1992, 34:85-91.

2 Pattinson JK,Millar DS,McVey JH,et al.The molecular genetic analysis of

hemophilia A: a directed search strategy for the detection of point mutations

in the human factor Ⅷ gene. Blood, 1990，76:2242-2248.

3 Tuddenham EGD, Schwaab R, Seehafer J, et al. Haemo-philia A: database of

nucleotide substitutions, deletions, insertions and rearrangements of the

factor Ⅷ gene. Nucl Acids Res, 1994, 22:3511.

4 Gitschier J, Kogan S, Levinson B, et al. Mutations of factor Ⅷ cleavage sites

in hemophilia A. Blood, 1988, 72:1022-1028.

5 Gitschier J, Wood WI, Tuddenham EGD, et al. Detection and sequence of mutations

in the factor Ⅷ gene of haemophiliacs. Nature, 1985, 315:427-430.

6 Antonarakis SE, Waber PG, Kittur SD, et al. Hemophilia A: detection of

molecular defects and carrier by DNA analysis. N Engl J Med, 1985,313:842-848.

7 Youssoufian H, Antonarakis SE, Aronis S, et al. Characterization of five partial

deletions of the factor Ⅷ gene. Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84:3772-3776.

8 Youssoufian H, Antonarakis SE， Bell W, et al. Nonsense and missense mutations

in the hemophilia A: estimate of the relative mutation rate at CG dinucleotides.

Am J Hum Genet, 1988, 42:718-725.

收稿：1996-12-18 修回：1997-05-16校对：仵乾玉