材料和方法

1 病例 血小板无力症(GT)患者2例由湖南医科大学附属湘雅医院确诊，另2例患者由北京协和医院确诊。

2 试剂 HIP8(结合位点在GPⅡb/Ⅲa)及羊抗鼠IgG-FITC由中国医学科学院血液学研究所李家增教授提供。CD₄₁-FITC(Coulter clone,结合位点在GPⅡb/Ⅲa),由Coulter公司提供。CD₄₁-PE(结合位点在GPⅡb)由Immunotech公司提供。 cD₆₁-FITC(结合位点在GPⅢa)由BD公司提供。1%多聚甲醛自制。

4.1 健康人静息血小板的标记:取健康人静脉血3ml,用3.8%枸橼酸钠按1∶9抗凝,分离富血小板血浆(PRP),用1%多聚甲醛(终浓度)固定15分钟,然后用PBS洗两遍,调整血小板浓度1×10⁹/ml备用。间接法:取血小板悬液100μl,加入HIP830μl, 在室温下温育30分钟;用PBS洗两遍,加入FITC标记羊抗鼠IgG20μl,在室温下孵育20分钟, 用PBS洗两遍,调整血小板浓度1×10⁹/ml,待测。直接法(双色标记)^［4］:取血小板悬液100μl,分别加入CD₆₁-FITC和CD₄₁-PE各20μl,在室温下孵育20分钟;用PBS洗两遍,调整血小板浓度1×10⁸/ml,待测。末梢血法^［5］:用采血针采集末梢血50μl,用PBS按1∶40稀释。取稀释后血小板悬液100μl,分别加入CD₆₁-FITC或CD₄₁-PE20μl,在室温下孵育20分钟。取20μl标记血小板悬液,用PBS稀释20倍,调整血小板浓度1×10⁸/ml,待测。

4.2 血小板无力症患者血小板的标记:取血及固定方法同前。用直接法(单色标记):取血小板悬液100μl,分别加入CD₄₁-FITC,CD₆₁-FITC或CD₄₁-PE各20μl,在室温下孵育20分钟,用PBS洗两遍,调整血小板浓度1×10⁸/ml,待测。

4.3 血小板的流式细胞术分析:选择激发波长为488nm的亚离子激光灯,调整前向角和测向角电压选出血小板群作门,取10000个血小板,测荧光阳性的标记血小板百分数。

4.4 统计学处理:平均数±标准差(±s)。

结 果

用单克隆抗体HIP8标记健康人静息血小板(间接法:羊抗鼠IgG-FICT作二抗),测得静息血小板GPⅡb/Ⅲa阳性血小板百分数为92.2%±2.0%(n=3);用直接法双色标记CD₆₁-FITC和CD₄₁-PE,测得GPⅡb和GPⅢa阳性的血小板的百分数为96.3%±0.7%(n=3);用末梢血法标记血小板,测得GPⅡb和GPⅢa阳性血小板百分数分别为96.7%±0.8%(n=3)和97.6%±0.7%(n=3)。

我们用直接法标记和分析了4例血小板无力症患者血小板膜GPⅡb/Ⅲa。4例患者GPⅡb/Ⅲa阳性血小板百分数分别为5.1%±0.9%,3.5%±1.0%(n=3),0.4%±0.1%和0(n=4); gPⅢa阳性血小板百分数分别为2.6%±1.1%, 0.2%±0.3%,9.5%±12.8%和0(n=4);GPⅡb阳性血小板百分数分别为68.7%±3.1%,0.2%±0.3%,15.6%±5.2%和0(n=4)。4例患者均为GPⅡb/Ⅲa复合物严重缺失;其中有3例患者GPⅢa完全缺失,2例患者GPⅡb完全缺失。

讨 论

血小板膜GPⅡb/Ⅲa复合物由GPⅡb和Ⅲa两个亚单位构成的含RGD结构的粘附分子受体。这些粘附分子包括纤维蛋白原,vWF,Vitronectin和纤维联结蛋白。GT时血小板膜缺乏GPⅡb/Ⅲa,此病的主要特征是血小板聚集功能障碍。

流式细胞术可以在单细胞基础上分析血小板膜糖蛋白,并具有快速、灵敏等特点。我们使用多种单克隆抗体采用了直接法、间接法和末梢血方法标记血小板,用流式细胞术多参数分析方法分析了健康人和GT患者血小板GPⅡb/Ⅲa,GPⅡb和GPⅢa,测得4例血小板无力症患者均为GPⅡb/Ⅲa复合物严重缺失;其中2例患者GPⅡb部分缺失。本实验所用方法均可用于检测血小板分子缺陷病,直接法较间接法简便,末梢血方法可用于新生儿和婴幼儿血小板分子缺陷病的诊断。

参 考 文 献

1 王美健,于爱新，李家增.单克隆抗体HIP2,Apt4,HI117和SJ-9A4对血小板胞浆钙离子浓度的影响.中华血液学杂志，1991,12:58-60.

2 王美健,李家增.抗GPⅡb/Ⅲa和CD9单克隆抗体对人血小板钙对流的影响.中国医学科学院学报，1993,15:339-342.

3 彭林,李家增,武怀珠,等.CD9单克隆抗体激活血小板的特性研究.中国医学科学院学报，1995,17:365-370.