ATⅢ基因在E.coli、Hela、Cos-1、酵母细胞、幼仓鼠卵巢细胞中得到表达。

2 遗传性ATⅢ缺陷症

2.1 分型：许多学者对于遗传性ATⅢ缺陷症的分型作了各种尝试，尽管许多病例仍不能很恰当地归类，但这些方案在提供功能异常与血栓发生频率之间的关系上仍有用处。1993年Lane等^［３］根据已知的各种突变及它们对ATⅢ功能的影响对经典分型方案进行了修改，修改后的方案如下：①Ⅰ型缺陷的ATⅢ的抗原性及活性均下降了约50%，不存在变异蛋白。②Ⅱ型,包括所有已发现变异ATⅢ蛋白的病例，ATⅢ的活性下降了约50%，大多数病例ATⅢ抗原量正常，但其中几乎有一半的ATⅢ抗原量是由变异蛋白提供的，它又可以分为三型：○a反应位点型(RS)：有反应位点异常的变异蛋白存在；○b肝素结合位点型(HBS)：有肝素结合位点异常的变异ATⅢ蛋白存在；○c多重异常型(PE)：有反应位点、肝素结合位点和血浆浓度多重异常的ATⅢ变异体存在。

2.2 分子基础：Ⅰ型缺陷症的基因改变大多是单碱基置换及小片段插入或缺失，至今约有60多种，几乎在各个家系中均不同。大的基因缺失相对较少，至今发现的仅有9种，但Phe⁴⁰⁸-Arg⁴¹³的缺失在4个毫无联系的家系中发生，在此缺失片段的5′和3′端存在着几个相同的碱基序列，众多学者认为缺失是在DNA合成中复制叉滑动错配导致的，故人类基因突变不是随机的，而是受到变异DNA所处环境的强烈影响。Emmerich等^［４］发现了一个105bp的大缺失，而此缺失的两端亦存在着重复序列，从而进一步证实了众人的推测。对于Ⅰ型缺陷症的ATⅢ抗原量降低，Lane等^［３］解释如下：①小的插入或缺失导致翻译的阅读框架的移动，从而翻译过早终止；②核苷酸取代导致过早产生终止密码子；③突变影响RNA的延伸；④变异产生不稳定的ATⅢ蛋白，这些ATⅢ蛋白不能输出到血液中或者其在血浆中的半寿期大大缩短。Ⅱ型缺陷症：Ⅱ型缺陷症的特征是因氨基酸置换反应导致功能降低的变异ATⅢ蛋白出现在血浆中。氨基酸的替换及其发生部位是表现型的决定因素。我们根据血浆中变异的ATⅢ蛋白的表现型特性可以初步判断基因的受影响区域。Ⅱ型缺陷症又可以再分为三个亚型，RS型：至今发现的RS型突变共有11种，其突变“热点”有两个，一个是在ATⅢ的反应部位Arg³⁹³-Ser³⁹⁴(P1～P1′),若此部位发生替换反应，必将导致对丝氨酸蛋白酶的抑制功能下降，降低程度随着丝氨酸蛋白酶种类的不同而改变，值得注意的是在P1′位置上因某些置换反应而存在的大侧链基团抑制了ATⅢ抑制凝血酶活性，但不影响其抑制比凝血酶小得多的FⅩa的活性，这可能是空间位阻效应^［５］，根据这些ATⅢ变异体的序列，人们可以人工合成出只对特异的丝氨酸蛋白酶(如FⅩa)有抑制作用的蛋白，这一点引起治疗学上的潜在兴趣；另一突变“热点”区在P10～P12区域，即Ala³⁸²-Ala³⁸⁴,这个区域在ATⅢ和丝氨酸蛋白酶复合物的形成中作用很大，若在这些部位发生置换反应，变异的ATⅢ仍然在反应部位与丝氨酸蛋白酶粘附，但失去了对其的抑制作用^［６］。HBS型： aTⅢ的肝素结合结构域是由位于蛋白质螺旋A和螺旋D的紧密相邻的5个带正电荷的氨基酸组成的一个阳离子密集区域。有两类残基的置换反应能导致其与肝素的亲和力降低：①与肝素链发生直接接触的残基，即组成 aTⅢ的肝素结合部位的残基，Arg⁴⁷→Cys,Ser,His及Arg¹²⁹→Glu均属此类，在这两种突变中不带电荷的残基取代了带正电荷的残基从而与SO₄^2-的亲和力下降。②与肝素结合部位相近，或影响ATⅢ的肝素结合部位构象的残基，Pro⁴¹→Leu,Leu⁹⁹→Phe,Ser¹¹⁶→Pro则属此类。氨基酸置换反应导致的Ⅱ型HBS变异体与肝素的亲和力下降到了原来的1/10～1/1000。PE型：PE型绝大多数变异体在外显子6的P9′～P14′区域有置换反应。这些变异的ATⅢ不能使丝氨酸蛋白酶失活，且其与肝素的亲和力也有相应的降低。对其机制的解释是：置换反应可能减轻了肝素结合部位的构造改变,或者可以阻止肝素结合部位的构造改变信息传递到反应中心。PE型变异ATⅢ蛋白在血浆中浓度较低，对其解释为：ATⅢ蛋白上相当于408～412位残基位置(P15′～P19′)有一个隐蔽位点，当ATⅢ与丝氨酸蛋白酶构成不可逆复合物时，这个位点就暴露出来被一种肝细胞受体——低密度脂蛋白受体(LRP)识别^［７］，从而介导复合物从循环系统中快速清除；当变异发生在与隐蔽位点很接近的部位，导致隐蔽序列的部分暴露被 lRP错误地识别为复合物从而清除出循环系统。新近，William等^［８］用定点突变改造了鼠的ATⅢ cDNA,造成一种PE型突变：ATⅢ-Utah突变，研究发现ATⅢ-Utah的含量降低是因为它在肝脏内的生成减少且分泌下降，从而提出另一种对PE型变异ATⅢ蛋白血浆浓度降低的新解释为肝脏合成或释放减少。

2.3 遗传性ATⅢ缺陷症的实验室检查：对于遗传性ATⅢ缺陷症的表型检查有两类，分别根据ATⅢ的质和量来设计。免疫实验是检测血浆中存在的抗原量，有火箭电泳、免疫扩散法、酶标免疫实验、放射免疫实验等，其最大的缺点在于不能区分出正常的ATⅢ蛋白。交叉免疫电泳可以初步区分异常和正常的ATⅢ蛋白，比其它方法更优越。功能性实验主要是检测其抑制凝血酶的活性，但这个实验受血浆中其它凝血酶抑制物如HC-Ⅱ的影响。Christine等^［９］发现ATⅢ抑制FⅩa的活性不受其它抑制物的影响，比测定其抑制凝血酶的活性更能反映真正的体内ATⅢ的活性。上述两类实验室检查结果可以用于遗传性ATⅢ缺陷症的初步分型，但进一步确定缺陷的类型、部位及机制仍需要通过分子生物学实验来进行。在检测ATⅢ基因缺陷的分子生物学技术中最经典的是聚合酶链反应(PCR)——直接测序^{［１０，１１］}，这种方法比较直接，不会遗漏任何类型的基因改变，但因必须系统地分段扩增出ATⅢ的全长并进行测序，所以工作量大，不适合作为常规检测手段。抽提待检者基因组DNA后通过酶切反应及Southern杂交可以检测出一些大片段缺失、重组^［１２］，但对于不影响酶切反应所用限制性内切酶的作用位点的点突变及小的插入和缺失就不能检测出。近年来，PCR-单链构象多态性(SSCP)^［１３］或PCR-变性梯度凝胶电泳(DGGE)的建立使检测基因变得简单，我们可以先确定变异发生的大体部位，再对缩小的范围采取测序方法确定具体突变，但此方法只可以检测出点突变和小的缺失及插入，对于大片段的插入和缺失无效。新近Perry等^［１４］从待检者外周血单核细胞中抽提RNA，应用逆转录PCR和直接测序的分析方法检测ATⅢ的基因改变，此方法简化了ATⅢ缺陷症的突变检测，减少了工作量，不失为一种值得提倡的方法。在遗传性 aTⅢ缺陷症家族中，若已知他们的具体突变类型，可以采用以下的方法进行其他家族成员的基因诊断。根据已知突变的DNA序列及正常DNA序列合成同位素标记的寡核苷酸探针，采取Dot-blot或lot-blot进行寡核苷酸区分杂交(ODH)^{［４，１５］}，这种方法适用于几乎所有的点突变及小片段的插入或缺失。若突变影响了限制性内切酶作用位点，可以采用PCR-限制性片段长度多态性RFLP)分析来检测此突变，ATⅢ kyoto突变影响了HaeⅢ酶切位点，Masuda等^［１６］采用此方检测了此缺陷症家族中其他成员获得成功，通过直接测序进一步证实了PCR-RFLP的准确性。大片段的插入或缺失亦可采用PCR-RFLP方法来测。

2.4 预防与治疗：人工提纯的ATⅢ生物制品已经在临床上用于治疗ATⅢ缺陷症^［１７］，它的危险度远远低于新鲜冻干血浆，但任何血浆成分的静脉注射都不能认为是绝对安全的。随着基因工程的快速发展，基因重组ATⅢ的出现可能会进一步提高ATⅢ用于临床治疗的安全性。

参 考 文 献

１ Olds RJ,Lane DA,Chowdhury V,et al.Complete nucleotide sequence of theantithrombin gene:evidence for homologous recombination causing thrombophilia.Biochem,1993,32:4216-4224