我们根据bcr-abl基因的特点，用重组聚合酶链反应(PCR)法定点改建b3a2型bcr-abl cDNA，得到b3a2和b2a2型bcr-abl cDNA的通用竞争内标物。在此基础上，我们建立竞争PCR法定量检测bcr-abl mRNA的方法并初步用于临床。

材料和方法

1竞争性内标物利用本室经重组PCR构建的bcr-abl cDNA中一276bp片段的类似物mimic,长240bp,较原276bp片段仅中间部分序列缺失，两侧引物结合区完全相同。将其克隆至pGEM-5Zf(+)质粒上，得到的pGEM-mimic经紫外分光光度计(UV)定量后作为内标物。克隆过程中得到的突变重组子pGEM-mimic(m),经测序证实缺失mimic中间一58bp片段，长182bp，作为 pGEM-mimic的竞争模板，以此建立竞争PCR的实验条件。

2竞争逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)外周血或培养细胞中总RNA提取、引物H和C序列、bcr-abl基因RT-PCR反应条件均按文献［1］进行。竞争PCR中，以pGEM-mimic为内标物，将不同稀释度内标物与待测cDNA混合，或与一定量pGEM-mimic(m)混合，以H、C为扩增引物，按文献［1］RT-PCR反应条件进行32次循环。扩增产物用8%PAGE电泳和银染显色鉴定，并经图像分析仪扫描定量。

3图像分析用IBAS图像分析系统(Kontron electronik,Italy)，扫描得到各电泳带平均吸光度(A，曾称光密度OD)值。分别求出各泳道中待测物(T)带与内标物(M)带的平均吸光度比值(A_T/A_M)。考虑到待测物与内标物扩增带大小的差异，对b3a2型乘以校正系数0.87(240/276)；对b2a2型乘以校正系数1.19(240/201)；对pGEM-mimic(m),乘以校正系数1.32(240/182)。以mimic的amol数为横坐标，A_T/A_M为纵坐标，绘制定量曲线，查出A_T/A_M=1时，横坐标上对应mi-mic的 amol数为待测物浓度。以amol(mimic) 1μg总

作者单位：510089广州，中山医科大学医学遗传学教研室［李巍(现在深圳市罗湖医院518001)、杜传书］

rNA为浓度表示单位。起始模板中，mimic为质粒双链，待测物为b3a2或b2a2 cDNA单链时，查得结果数应再乘校正系数2。

4实验对象培养的K562细胞株为b3a2型bcr-abl mRNA阳性对照。1例b3a2型慢性粒细胞白血病(CML)患者，实施干扰素联用羟基脲化疗1年后，白细胞由治疗前的320×10⁹/L下降到7.5×10⁹/L，此时做第1次定量测定(K1)。1个月后患者白细胞升至12.9×10⁹/L，做第2次定量测定(K2)。继续上述化疗方案半年后，白细胞降至8.3×10⁹/L，做第3次定量测定(K3)。

结果

1竞争PCR的循环次数竞争PCR用于定量时的最佳条件是选择待测基因和内标物PCR扩增的同步增长期。将等浓度的pGEM-mimic和pGEM-mimic(m)各1μl加于25μl的PCR反应体系中，按竞争PCR条件进行20，25，32，35，40次循环。以循环次数为横坐标，扩增产物吸光度值为纵坐标，绘制图1。表明两者的指数变化期均为25～35个循环。选择32次循环为实验条件。

图1竞争PCR循环次数试验

2准确性与重复性用已知浓度为108fmol的pGEM-mimic(m),分别用55，92，110，183，550fmol的pGEM-mimic内标物进行竞争PCR定量。求得5次pGEM-mimic(m)浓度分别为119，105，98，100，108 fmol,为106 fmol,s=8.28,CV=7.8%。表明竞争PCR准确可靠，重复性好。

3线性范围分别将130，260，390，520，780 amol k562细胞b3a2型mRNA与275 amol pGEM-mimic进行竞争试验(见图2中6～10泳道)。以K562 b3a2 mRNA amol数为横坐标，测定的A_T/A_M为纵坐标，绘制图3。线性检测范围达520 amol。

1～5：K562细胞株定量PCR；6～10：线性试验；

11：1kb分子量标准

图2K562细胞株定量PCR及其线性试验电泳图谱

图3定量PCR线性试验

4灵敏度试验将550 fmol pGEM-mimic渐次稀释到10^-8仍可见扩增带，表明可检出到5.5×10^-3amol水平，相当于331个分子数目。H、C引物扩增K562 mRNA可检出 10^-5μg水平^［1］，即可检出2.08×10^-3amol水平，相当于125个分子数目。

5临床应用分别将11，5.5，2.75，1.375，0.6875 fmol的pGEM-mimic与1.25μg K562总RNA混合，进行竞争PCR定量试验(见图2中1～5泳道)。测得其中b3a2型mRNA含量为208 amol/μg总RNA，即1.25×10⁷个分子/μg总RNA。

另外观察了1例b3a2型CML患者，在应用干扰素和羟基脲治疗过程中bcr-abl mRNA的动态变化(K1→K2→K3)。含量变化为96×10^-3→96→96×10^-3amol/μg总RNA，K2是K1和K3的1000倍。表明该CML患者随病情变化，bcr-abl mRNA的含量发生相应变化。

讨论

竞争RT-PCR法已被广泛用于mRNA的绝对定量，其准确性也受一些因素的影响^［2］。一般认为，逆转录效率达不到100%时，会低估RNA的含量，多主张内标物经体外转录为RNA，再与待测RNA进行逆转录和PCR。但也有作者指出，标准化实验条件后，RNA水平与DNA水平加入竞争内标物，得到相似的结果，可以不考虑逆转录效率的影响，直接选用DNA内标物，不经体外转录步骤进行竞争PCR。我们采用重组质粒与cDNA待测模板进行的竞争PCR定量试验结果也表明其简便、可靠。mRNA定量误差的其它重要来源是提取的总RNA中mRNA的完整性和纯度、核酸浓度测定的准确性等。待测模板与内标准物的结构上的细小差异(如片段长度、单链或双链、线状或环状)和拷贝数目的不同，都可能影响到PCR扩增效率，从而引起定量误差。值得注意的是，当两者拷贝数差别较大时，扩增产物中仅出现其中一种(如图2中第1和10泳道)，无法得到A_T/A_M值。也提示在bcr-abl mRNA的分型诊断中，对于 b3a2与b2a2混合型标本，某些情形下因两者拷贝数的含量不同，可能仅出现其中一条带，引起分型的错误。作者认为，近年来有关bcr-abl

mRNA类型与临床表现的不一致报道中，不能忽视这种分型的错误而带来的统计误差。

我们建立的竞争PCR定量bcr-abl mRNA的方法，表明其简便快速、不需使用同位素，结果准确可靠、重复性好、灵敏度高、线性检测范围广，适于临床推广使用。

参 考 文 献

1李巍，杜传书.白血病BCR-ABL融合基因逆转录PCR中的影响因素探讨.中山医科大学学报，1997，18：16-20.

2Souaze F,Ntodou-Thome A,Tran CY,et al.Quantitative RT-PCR：limits and accuracy.Bio Techniques,1996,21:280-285.

(收稿：1997-06-13修回：1997-10-28)

(校对：张吉贤)

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