关键词： 白血病，粒-单核细胞性，急性；融合基因，CBFβ-MYH11；聚合酶链反应；荧光原位杂交

摘要目的：探讨inv(16)和CBFβ-MYH11融合基因在急性髓系白血病M_4EO型的临床诊断、预后判断中的意义。方法：用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和荧光原位杂交(FISH)技术分别检测急性粒-单核细胞白血病(M₄)患者的CBFβ-MYH11融合基因转录本和inv(16)。结果：在15例中国人M₄中，10例患者用RT-PCR方法检测CBFβ-MYH11融合基因转录本，其中9例不伴异常嗜酸粒细胞的M₄中有1例阳性；1例伴异常嗜酸粒细胞增多(M_4EO)为阳性。随访该例完全缓解2个月后，其PCR仍持续阳性。用FISH技术检测的9例M₄中得到的2例阳性病例，与PCR方法测得的结果完全一致。结论：对M₄患者无论其经典的染色体核型分析有无16号染色体异常的提示，都应用RT-PCR和FISH方法检测CBFβ-MYH11融合基因进行筛选，这对M₄的临床诊断、预后判断等具有重要临床价值。

Detection of CBFβ-MYH11 fusion transcript and inv(16)(p13;q22) in acute myelomonocytic leukemia(M₄) by RT-PCR and FISH He Kaili,Gu Buowei,Cao Qi,et al.Shanghai Institute of Hematology,Shanghai Second Medical University,Shanghai200025

Abstract Objective:To study the clinical significance of inv(16) and CBFβ-MYH11 fusion gene in the diagnosis and prognosis for M_4Eo.Methods:CBFβ-MYH11 fusion transcripts and inv (16) were analyzed by reverse-transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR) and fluorescence in situ hybridization(FISH),respectively,in acute myelomonocytic leukemia(M₄) with or without eosinophilia.Results:In fifteen cases tested,one case of M_4Eo and one of 9 M₄ without eosinophilia were found to have CBFβ-MYH11 fusion transcript.Follow-up of the M_4Eo patient showed residual PCR positivity 2 months after complete remission.Conclusion:The data suggest that screening by both RT-PCR and FISH should be performed in all AML-M₄ regardless of morphologic features to allow accurate diagnosis and prognosis of M₄ patients.

Key wordsLeukemia,myelomonocytic, acuteFusion gene,CBFβ-MYH11 Polymerase chain reactionFluorescence in situ hybridization

急性髓细胞白血病(AML)中急性粒-单核细胞白血病(M₄)伴异常嗜酸粒细胞增多这一独特亚型被定名为AML-M_4EO，以往的诊断主要根据细胞形态学、组化以及嗜酸粒细胞比例^［1］。由于该亚型在M₄中预后较好，故提高检出率尤具临床意义。绝大部分M_4EO都提示有16号染色体结构异常，较为特异和常见的是16号染色体倒位，即inv(16)(p13;q22),但用传统的核型分析，特别是R带技术检出率较低。随着对16p和16q断裂点的克隆，已明确inv(16)累及的是16号染色体长臂的CBFβ基因和短臂的MYH11基因，倒位的结果形成CBFβ-MYH11融合基因^［2，3］。我们建立了半筑巢式逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术，用以检测该融合基因转录本，并联合运用荧光原位杂交(FISH)技术对受累基因的重排进行检测，为研究M_4EO白血病的发病机制、临床诊断及预后判断提供了特异的分子标志。

材料和方法

1标本来源15例患者样本由上海第二医科大学瑞金医院、仁济医院，上海市第一人民医院，上海医科大学中山医院提供，其中男10例，女5例，年龄为3～74岁。根据FAB标准分类法诊断，14例为M₄，1例为M_4EO，标本来自初发和完全缓解后2个月。

2细胞遗传学15例患者的骨髓和(或)外周血经短期培养(37℃，24小时)，用秋水仙素终止于有丝分裂中期，应用R带和(或)G带技术进行染色体显带分析，分析15个以上分裂中期细胞，核型分析根据染色体国际命名法(ISCN1991)。

3半筑巢式RT-PCR检测CBFβ-MYH11转录本

3.1RNA制备：应用一步法异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提细胞总RNA^［4］。

3.2RT-PCR法：根据CBFβ-MYH11融合基因顺序，并参考文献［5，6］，设计了5个寡核苷酸引物和探针(模式图见图1)：逆转录反应引物A，第一步PCR反应引物B、C，第二步PCR反应引物D(3′端引物同C)，寡核苷酸探针E。其顺序如下：

A：CTCTTGTAGCTGCATGAGGTCTG

B：5′-GACGGCAAGGTATATTTGAAG-3′

C：5′-CTCTTCTCCTCATTCTGCTC-3′

D：5′-GGGCTGTCTGGAGTTTGATG-3′

E：AGGAAATGGAGGTCCATGAG

3.2.1逆转录反应：在40μl总体系中进行，包括总RNA 1μg，逆转录引物100ng，500mmol/L dNTP，MMLV逆转录酶200U，于37℃孵育45分钟。

3.2.2PCR反应：反应总体积为50μl，包括寡核苷酸引物0.3μmol/L,dNTP浓度各为200μmol/L,缓冲液浓度Tris-HCl 10mmol/L,pH8.4,MgCl₂ 1.5mmol/L,Taq聚合酶1.5U。扩增条件为94℃变性5分钟，94℃变性45秒，退火57℃1分钟，72℃延伸1分30秒，共30个周期，最后1周期延伸时间为72℃7分钟。第二步反应的模板为第一步反应产物100倍稀释后取10μl，退火温度59℃，共25个周期。每一反应均设阴性对照，包括非M₄ RNA标本和无RNA标本的空白对照。

3.2.3PCR产物的检测：取10μl PCR产物，在1.6%琼脂糖凝胶进行电泳，用溴乙锭(0.5μg/L)染色，紫外灯下照相。

3.2.4PCR产物的测序：取第二轮PCR产物5μl，加入exonucleasel和Shrimp alkaline phosphatase预处理。利用Sanger末端终止法原理，采用 Dye Terminnater标记法，在ABI377自动测序仪上，用4%聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳，电压1.68kV,电流50mA，约7小时。

4FISH从法国人类多态性研究中心(CEPH)的酵母人工染色体库筛选出的854E2克隆作为探针，它跨越16p13区域^［2］，经inter-Alu-PCR扩增后，将Biotin-21-dUTP以缺口平移法标记YACDNA探针，同时掺入³H-dATP以监测Biotin的掺入率约40%。原位杂交法：总杂交体系12μl，含90ng的YACDNA，1000×胎盘DNA(10mg/ml),50%甲酰胺，2×SSC，10%硫酸葡聚糖，pH8.0。将探针在72℃变性8分钟后，在37℃温育1小时进行预杂交。玻片在70%甲酰胺，2×SSC，pH7.0的变性液中70℃变性2分钟，并经70%，80%，90%，100%系列乙醇脱水。将预杂交后的探针加入玻片上，盖上盖玻片(22mm×22mm)，用胶封片，置湿盒中37℃杂交过夜。次日，将玻片在45℃的50%甲酰胺，2×SSC，pH7.0溶液中洗涤3次，每次3分钟；2×SSC(pH7.0)溶液中洗涤3次，每次2分钟；0.1×SSC洗涤2次，每次2分钟；BN溶液中洗涤1次。经Biotin标记的探针再用Avidin-FITC(5μg/ml),然后再用单抗Avidin抗体(10μg/ml)检测。最后染色体加碘化丙锭(0.8μg/ml)/抗淬灭剂染色。选择NikonUFX-DX荧光显微镜双色滤片组合B-2A进行观察，并通过染色体自动分析仪Cytovision进行图像摄取和分析。染色体R带显带法：用Hoechst 33258(100μg/ml)溶液染色15分钟，用水漂洗后将玻片浸于水中，置365nm紫外灯下照射20分钟，并于87.5℃的Earle液中加热3分钟后经42℃1×BN溶液浸泡1分钟，再置室温1×BN中。

A～D为寡核苷酸引物；E为寡核苷酸探针；nt495为CBFβ基因的断裂点；nt994，1201，1921为MYH11基因的断裂点

图1用RT-PCR扩增CBFβ-MYH11融合基因的模式图及测序结果

结果

1细胞遗传学对15例M₄患者，包括1例M_4EO进行染色体分析，除1例M_4EO患者可见明显的16号染色体异常外，14例M₄中有1例亦可检测到inv(16)。

2半筑巢式PCR技术的特异性在10例受检的M₄患者中，2例细胞遗传学证实有inv(16)的患者均见分子量一致的扩增条带(322bp)并用直接测序的方法对第二轮PCR产物测序，证实为剪接转录本A型，证明此法对CBFβ-MYH11融合基因转录本的检测有高度特异性。

3半筑巢式PCR技术的敏感性及其与DNA印迹法的比较为探讨该法的灵敏度，我们对1例阳性患者进行敏感度测定，取其1μgRNA,以非M₄白血病患者RNA作为稀释剂进行1∶10～1∶10⁷连续稀释，再进行半筑巢式PCR反应。结果患者RNA稀释至1∶10⁴时，仍可见反应扩增带，反映了本法的敏感性(见图2)。