1材料和方法1．1材料Tyrphostin-5l、PD098059、N-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES)、钒酸钠(Na3、VO4)、亮抑蛋白酶肽(leupeptin)、抑蛋白酶肽(aprotinin)、1，10-菲珞啉(1，10-phenanthroline)、二硫苏糖醇(DTT)、精胺、亚精胺、NP-40、三硝基甲苯(TritonX-100)和苯甲基璜酰氟(PMSF)屿购自美国Sigama公司，蛋白质定量检测试剂盒(Proteinassaykit)购自美国Bio-Rad公司，a-32P-UTP和γ-32p-ATP购自北京亚辉生物试剂公司，2,5-二苯基唑(PPO)和1，4-双-[S-酚-2-恶唑]-苯(POPOP)购自上海化学试剂厂，其他试剂为国产分析纯,LS6500型闪烁仪为美国Beckman公司产品，透析袋购自北京东方试剂仪器公司，♂成年SD大鼠(220g～250g，第一军医大学动物所提供),禁食24h,以4mL(20mmol/L)去氧胆酸钠灌胃损伤胃粘膜，应用PTK抑制剂Tyrphostin-51(300μg·kg-1)和MAPKK抑制剂PD098059(150μg·kg1)，分别于生理盐水或DOC灌胃前1h和30minip,以同样方法注射生理盐水作为对照,每组动物6只．于胃损伤后的3h和6h取胃，取材时胃粘膜以预冷PBS冲洗干净，将整胃取下，液氮速冻后转移至-70℃保存备用。1．2方法1．2．1c-myc体外转录分析参见Kumanrietal[1]作了适当改进，刮取胃粘膜100mg，加1mL预冷的匀浆缓冲液(BufferA：50mmol/LTris-HC1,pH7.5；25mmol／LKC1；1mmol/LEGTA；1mmol/LEDTA;0.20mmol/L精胺；1．5mmol/L亚精胺；0.1mmol/LDTT；0．5mmol/LPMSF;1μmol／Lleupeptin；10mmol／Lβ-巯基乙醇；0．5mol/L蔗糖)进行组织匀浆，尼龙滤布过滤后4℃10000×g离心15min，沉淀重悬于1mL含5mL／LtritonX-100的匀浆缓冲液，再次匀浆，匀浆液小心铺于等体积BufferB(含0.88mmol／L蔗糖的BufferA)层上，4℃15000×g离心15min,小心吸弃上清，沉淀重悬于细胞核保存液BufferC(50mmol／LTris-HC1，pH8．0；5mmol／LMgCl2；0．1mmol／LEDTA；400mL／L甘油；0.1mmol／LDTT；0.5mmol/LPMSF；1／μmol／LLeupeptin；10mmol／Lβ-疏基乙醇)中，-70℃保存备用，取90μL细胞核悬液，加100μL2×转录缓冲液(10mmol／LTris-HCl，pH8．0，5mmol／LMgCl2,0．3mol／LKCl，5mmol／LDTT，ATP．CTP,GTp各1mmol／L)和10μLa-32P-UTP(3．7MBq，IIIMBq/μmol),置37℃保温30min,反应后用100URNase-freeDnaseI(溶于300μLDNaseIbuffer，20mmol/LHEPES,pH7．5mmol／LMigCl2，1mmol／LCaCl2)30℃消化5min，然后用100μL蛋白酶K缓冲液(0．5mol／LTris-HCl,pH7．4，125mmol／LEDTA，50mL／LSDS)和5μL蛋白酶K(20mg/mL)42℃消化30min,之后加等容积酚／氯仿/异戊醇(24：24：1，v／v/v)提取2次,乙醇沉淀，以适量TE溶解新转录的RNA．取1μg经线性化的未标记c-mycDNA片段点于NC膜上，空气自然凉千后，于80℃烤箱中烤膜2h将载有c-myc片段的NC膜密置于杂交袋中，加入杂交液(10mmol／LTES，pH7.4；10mL／LSDS;10mmol/EDTA;0.3mmol/LNaCl;1×Denhardt;250μg鲑精DNA；107dpm标记RNA)，杂交袋密封后置于65℃反应48h杂交后经2×SSC，65℃洗膜2×30min，经10μg/mLRnase(溶于2×SSC)37°C消化30min，再经2×SSC37℃洗膜30min，空气凉干，杂交后的膜片用于放射自显影和经液闪计数(4mL／LPPO．0.2mL／LPOPOP，溶于甲苯溶液)，每一样品设2个平行管，取其平均值进行结果分析。1．2.2细胞核蛋白质磷酸化的检测参见高静etal[2],作适当改进，取1mg细胞核粗提物，置于500μL反应体系(50mmol/LTris-HCl，pH7．4．10mmol／LMaCl2,50μmol／LCaCl2)中混匀，37℃预保温3min，加入2μLγ-32P-ATP(370kBq/μL)，37℃反应30s后转入冰浴，迅速加入500μL．125μL／LTCA，剧烈振荡10s，静置10min后沸水浴3min，12OOO×g离心20min，沉淀用1mL反应缓冲液重悬，再次12000×g离心10min，洗涤沉淀3次后用1mL反应缓冲液再次重悬，而后加4mL闪烁液(0．4％PPO，0.02％POPOP，溶于甲苯溶液)用LS6500型闪烁仪进行闪烁计数，每一样品设2个平行管，取其平均值进行结果分析。统计学处理各组间的比较用方差分析逆行统计。2结果胃粘膜损伤后3h，细胞核蛋白质的磺酸化程度增加了408％，分别应用PTK抑制剂tyrphostin-51和MAPK抑制剂PD098059，使细胞核蛋白质的磷酸化程度抑制了85％和62％(表1)。胃粘膜损伤后6h，体外核转录分析表明c-myc的转录提高了251％，应用tyrphostin-51和PD098059，使c-myc的转录分别抑制了59％和53％(表2)。表1不同阻断剂对胃粘膜损伤后细胞核蛋白质磷酸化影响的比较表2不同阻断剂对胃粘膜损伤后c-myc影响的比较3讨论胃粘膜在受到一定程度的损伤性刺激后，可启动快修复机制使胃粘膜迅速恢复其完整性，以避免损伤向深层发展，这是胃粘膜抵抗疾病的一种重要的屏障能力[3-5]。胃粘膜快修复机制主要表现为损伤区周围或深部活细胞的迁移，由于不需要DNA的复制和蛋白质的合成，只需要对细胞内一系列功能蛋白质的适当修饰即可完成，因而是一快速的反应，但这种机制仍不甚清楚，在胃粘膜损伤修复过程中，生长因子多肽参与其调节，而蛋白酪氨酸激酶(PTK)是生长因子受体胞内区行使信号传递的一个主要的功能部分，其活性变化必然对胃粘膜修复具有重要影响。胃粘膜损伤后及时维持其自身完整性的一种快速修复机制与损伤刺激粘膜发生早期的生化改变有很大的关系，这些早期的生化改变包括TGFa等生长因子的反应性增高，受体酪氧酸激酶的激活，细胞内Ca2+的增高，NO的合成以及细胞的碱化等[4，5]，但发生在细胞膜和细胞质内的这样一些早期生化改变是否就足以促使细胞活化并进行迁移等修复反应呢?这种机制几乎仍是个谜。在我们的研究中发现，胃粘膜损伤后的一些早期基因表达增高，Yoshiuraetal[6]和Itoetal[7]也有相似的发现，说明与细胞膜和细胞质的生化改变相呼应，细胞核发生显著的生化改变参与胃粘膜完整性的早期修复，也只有细胞核的参与才使粘膜具有更好的修复能力，并且是一种有控制的修复过程，但涉及到细胞核基因的转录需要一定的时间以准备基因复制所需的物质基础，这与胃损伤后粘膜必需作出非常快速的反应是不相符的。近年研究发观，这些早期基因编码的产物很多是转录因子[6，8]，而且有些属组成型(constltutive)表达，只需进行适当的修饰如磷酸化调节即可对细胞的功能产生影响，转录因子具有改变受体介导特殊靶基因的转录效率，在受体激活后可被快速而短暂地诱导，所以，它们的基因又被称为是立即早期基因(immediateearlygenes,IEGs),它们参与损伤刺激的快速反应。细胞核蛋白质的磷酸化是基因转录妁重要条件，其重要机制之一是通过影响转录因子的活性，我们观察到，受体酪氨酸蛋白激酶激活后，经细胞内的信号传导，其效应被显著放大了，表现为细胞核蛋白质的磷酸化的提高和c-myc转录的增强等。而MAPK是影响PTIK向细胞内的信号传递的重要途径，应用MAPK抑制剂，细胞核蛋白质的磷酸化程度被抑制了62％，使c-myc的转录效率降低了53％。C-myc的转录以及随后的翻译对细胞增殖具有重要的意义[9]，因为c-myc是促进细胞由G1期进入S期的关键因素，我们认为胃粘膜损伤后，c-myc的表达增加对粘膜的完整性修复具有积极的意义，抑制PTK的活性以及抑制其后的MAPK通路，使细胞核蛋白质磷酸化和c-myc转录明显抑制的同时，也明显抑制了细胞的增殖性信号。总之，细胞膜受体蛋白酪氨酸激酶激活后，经细胞内信号传导的级联放大，明显提高了细胞对损伤的修复反应能力，这些通路最后汇集到细胞核，使细胞核的磷酸化程度明显增高，并使早期基因C-myc的转录明显增加是胃粘膜损伤后修复的重要机制。

参考文献：

［1］Kumari M,Stroud JC,Anj a,McCarrey JR.Differential appearance of Dnase I-hypersensitive sites correlates with differential transcription of Pgk genes during spematogenesis in the mouse.J Biol Chem,1996；271：14390-14397

［2］高静，吴馥梅，萧信生，王新光，行为训练与小鼠海马突触蛋白磷酸化水平的相关性，生理学报，1992；44：86-91

［3］曾锦章，张万岱，周殿元，胃肠调节肽与胃粘膜修复关系的研究进展，中国实用内科杂志，1999；19：98-100

［4］Paimela H,Goddard PJ,William S.Present views on restitution of gastrointestinal epithelium.Dig Dis Sci,1995；40：2495-2496

［5］Playford RJ.Peptides and gastrointestinal mucosal integrity.Gut,1995;37:595-597

［6］Yoshiura K,Ota S.Terano A,Takahashi M,Hata Y,Kawabe T,Mutoh H,Hiraishi h,Nakata R,Okano K,Okano K.Growth regulation of rabbit gstric epithelial cells and protooncogene expression.Dig Dis Sci,1994；39：1454-1463

［7］Ito T,Hayashi N,Sasaki Y,Morita Y,Kawano S,Fusamoto H,Sato N,Tohyama m,Kamada T.Sequential protooncogene expression during regenration in rat stomach.Gastroenterology,1990；98：1525-1531

［8］McMabon S,Monroe JG,Role of primary respnse genes in generating cellular respones to growth factors.FASEBJ,1992;6:2707-2715

［9］Marcu KB,Bossone SA,Patel AJ.myc function and regulation.Annu Rev biochem,1992;61:809-860

收稿日期：1999-08-10