摘要：目的观察Bel-2核酶对SMMC-7721细胞的作用，探讨bcl-2抑制细胞凋亡的机制。方法经脂质体介导的方法将PMTr-neo(正向Bcl-2核酶真核表达载体)导入SMMC7721细胞中．细胞克隆转移扩大培养后，采用TUNEL,TRAP结合ELISA流式细胞仪，免疫组化技术检测SMMC7721／PMTr-neo细胞增殖及细胞凋亡。结果 较对照组SMMC 7721／PMTr-neo细胞bcl-2表达水平显著下降，伴有显著细胞凋亡现象及端粒酶活性下降，结论 bcl-2核酶可促进SMMC 7721细胞发生凋亡，并降低细胞端粒酶活性，为反义技术在肝癌治疗中应用提供理论依据。

Promotion of apoptosis of SMMC7721 cells by Bcl-2 ribozyme

Chuen Shan Zheng ,Wen liang Wang(Department of Pathology,University,Xian 710033,Shaanxi Province,China)

wei Dan Peng(Department of Biochemistry,Fourth Military Medical University,Xian710033,Shaanxi Province,China)

peiZhen Hu(Department of Pathology,University,Xian 710033,Shaanxi Province,China)

yu Bo Chai(Department of Biochemistry,Fourth Military Medical University,Xian710033,Shaanxi Province,China)

fu Cheng Ma(Department of Pathology,University,Xian 710033,Shaanxi Province,China)

Abstract：AIM to observe the effect of Bcl-2 ribozyme on SMMC 7721 cells and to investigate bcl-2 inhibition of cellular apoptosis.METHODS PMTr-neo (sense Bcl-2 ribozyme eucaryotic expression vector) was introduced into SMMC7221 cells by using lipofectin mediation; TUNEL and TRAP were used in combination of EMSA and IHC to determine SMMC7721/PMTr-neo proliferation and apoptosis.RESULTS Compared with the control, SMMC7721/PMTr-neo presented a significant drop in bcl-2 expression,accompanied by remarkable apoptosis and telomerase activity decline.CONCLUSION Bcl-2 ribozyme promotes apoptosis ofSMMC7721 cells and reduces telomerase activity. Thisprovides a theoretical basis for applying antisense technique to treatment of hepatecarcinoma.

Keywords：liver neoplasms; Bcl-2;ribozyme; apoptosis; SMMC 7721

0引言bcl-2是凋亡研究中最受重视的癌基因之一，bcl-2对细胞增殖与凋亡的影响作用被认为在肿瘤发生过程中有着重要意义[1-3]，尽管对bcl-2抑制细胞凋亡的现象进行了较深入的研究，但具体机制仍不清楚．到目前为止，在不同的生物种发现的bcl-2基因家族成员至少有16种，分别为：bcl-2，bcl-x1，bfl-1，mbcl-x，ced-9,bhrfl，lmw5-hl，nr-13,bcl-xs，bax,bak，bad，brag-1，mcl-1，grs和ai等，按其基本功能可分为两类：bcl-2，bcl-x(1)，bfl-1，mc-1，ai，mbcl-x，ced-9，bhrf1，lmw5-h1，nr-13等具有抑制凋亡作用，而bax，bcl-x(s)，bak，bad等具有促进凋亡作用．核酶是一类具有酶活性的RNA分子，可在分子内及分子间切割靶RNA．核酶的出现为基因治疗提供了强有力的手段．也为研究特定基因功能提供了有效的方法．我们采用脂质体介导的基因转移方法将Bcl-2核酶导人人肝癌细胞株SMMC7721细胞中，结合TYBEK及免疫组化等技术观察Bcl-2核酶对SMMC7721细胞的影响，目的在于为肿瘤基因治疗提供理论依据。1材料和方法1．1材料大肠杆菌JMl09由本校生化教研室惠赠，PMTr-neo质粒由彭玮丹博士惠赠，核酸内切酶购自Promega,脂质体转染试剂盒购自Gibico，凋亡检测试剂盒购自BoehringerMannheim，SMMC7721细胞由本室保存培养.1．2方法1．2．1PMTr-neo转染SMMC7721细胞①PMTr-neo质粒的鉴定：将PMTr-neo质粒转化JMl09大肠杆菌，扩增提取质粒，经核酸内切酶BamHI，EcoRI双酶切后，电泳鉴定Bcl-2核酶片段大小正确．②PMTr-neo转染SMMC7721细胞：把处于对数生长期的SMMC7721细胞分为两组：对照组SMMC7721细胞和实验组转染PMTr-neo的7721细胞，转染方法按脂质体转染试剂盒说明书操作步骤进行，培养48h后传代加入含G4l8550mg／L的培养液筛选抗性细胞．继续培养2wk后，可见细胞克隆形成．③SMMC7721／PMTr-neo细胞的鉴定：细胞克隆扩大培养后，制作细胞爬片，丙酮固定，免疫组化检测．Bcl-2单抗购自博士德生物公司，免疫组化按照Dako公司．EnvisionTM+System，HRP试剂盒说明进行．免疫组化检测步骤如下：30mL／LH2O2封闭30min；30g／LBSA封闭30min；加一抗4℃过夜；加DakoEnvisionTM+System，HRP，mouse，(R4001)；显色苏木精衬染封片，同时设立对照实验.1．2．2BcL-2核酶对SMMC7721细胞促凋亡作用①TUNEL检测：细胞克隆扩大培养后，细胞爬片，用100μmol／L硫酸锌诱导Bcl-2核酶表达．36h～48h后检测细胞凋亡情况．实验操作步骤参照InSituCellDearhDetectionKit，AP说明书进行．②TRAP结合ELISA端粒酶活性检测：Telomerase-PCR-ELISA．AP试剂盒购自BoehringerMannheim公司，细胞端粒酶活性检测按照Telomerase-PCR-ELISA．AP试剂盒说明书进行．并设立阳性及阴性对照实验．在DynatechMR400仪器上检测450nm／63nm处标本的吸光度(A)值．③流式细胞仪检测收集SMMC7721／PMTr-neo细胞及SMMC7721细胞750mL／L酒精溶液固定，检测前离心去酒精，加人250mg／LPI(碘化丙锭)0．2mL，暗处放置30min，上机检测．测定细胞周期，去酒精，加入250mg／LPI(碘化丙锭)0．2mL，暗处放置30min，上机检测．测定细胞周期，观察是否存在凋亡细胞.2结果2．1TUNEL检测结果光镜观察可见SMMC7721／PMTr-neo较对照组细胞凋亡数量显著增多(图l，2)在高倍视野(×400)下，选择5个视野分别计数200个细胞，统计凋亡细胞所占百分比，发现实验组凋亡细胞24±4/200(12％)，比对照组(8±3／200，4％)明显增多(P＜0．01，x2=7．643).2．2免疫组化检测结果在SMMC7721／PMTr-neo细胞中，未能检测到Bcl-2蛋白，而对照组Bcl-2结果为阳性(图3，4)，说明在Zn2诱导下Bcl-2核酶有效表达，在转录水平上封闭了bcl-2表达.图1SMMC7721细胞自发凋亡(x400,TUNEL法，AP显色)图2Bcl-2核酶诱发SMMC7721细胞凋亡．(×400，TUNEL法，AP显色)图3SMMC7721细胞Bcl-2阳性表达．(×400，DakoEnvisionTM+System，HRP,苏木精衬染)图4Bcl-2核酶转染SMMC7721细胞Bcl-2阴性表达．(×200，DakoEnvisionTM+System，HRP，苏木精衬染)图5SMMC7721／PMTr-neo细胞周期分析结果。2．3TRAP结合ELISA端粒酶活性检测结果TRAP-PCR-ELISA法的结果显示，SMMC7721细胞表达高水平的端粒酶活性，吸光度(A450～A630)值为2．861，而转染Bcl-2核酶的细胞SMMC7721／PMTr-neo端粒酶活性表达显著下降，吸光度(A450～A630)值仅为0．980．说明转染Bcl-2核酶对SMMC7721细胞端粒酶活性有—定影响。2.4流式细胞仪检测结果SMMC7721／PMTr-neo细胞与对照组细胞相比，细胞周期变化不明显，各期细胞所占百分比为：G1期(59．3％vs57．2％)、S期(30．3％vs40．5％)、G2期(10.4％vs2.3％)，细胞数量与对照组细胞差别不大，但检测出SMMC7721／PMTr-neo细胞在G1期前有一亚二倍体的凋亡峰,凋亡细胞占全部细胞的2．5％，对照组未出现凋亡峰(图5)。3讨论凋亡是细胞死亡的一种生理机制，在调节组织内环境稳定过程中起重要作用．凋亡的调节是一种非常复杂的过程，涉及到许多基因的表达．抗凋亡基因bcl-2是其中最受关注的基因之一．核酶是一类具有酶活性的RNA分子，具有分子内和分子间切割靶RNA分子的功能，通过核酶来抑制肿瘤生长从而达到治疗目的已成为治疗肿瘤的新途径。我们将带有锤头状Bcl-2核酶的可诱导真核表达载体通过脂质体介导方法转入SMMC7721培养细胞中，目的在于通过Bcl-2核酶阻断bcl—2表达，来观察Bcl-2核酶对SMMC7721细胞的影响．结果表明，转染Bcl-2核酶的SMMC7721细胞bcl-2表达水平显著下降，采用免疫组化方法未能检测出转染Bcl-2核酶的SMMC7721细胞中的Bcl-2蛋白，TUNEL及流式细胞仪检测结果表明，转染Bcl-2核酶后，可诱导细胞凋亡，但细胞凋亡数量并不显著，凋亡细胞仅占全部细胞的2．5％。说明尽管抑制了bcl-2表达，但仍可能有其他蛋白继续发挥抗凋亡作用，同时抑制bcl-2表达，对细胞周期似无明显影响，经TRAP-PCR-ELlSA检测还发现转染Bcl-2核酶基因的SMMC7721细胞端粒酶活性降低，吸光度值仅为0．980(对照组为2．861)．说明转染Bcl-2核酶对SMMC7721细胞端粒酶活性有一定影响.Doraietal[4,5]观察到Bcl-2核酶对前列腺癌细胞有明显促凋亡作用．并认为运用Bcl-2核酶治疗肿瘤是一种可行的有效方法．但也有人发现．Bcl-2核酶对慢性髓细胞白血病细胞没有明显的促凋亡作用[6]，我们的实验结果与文献报道的结论相似．Bcl-2核酶对肝癌细胞有促凋亡作用，但并不显著，说明bcl-2抑制细胞凋亡需要与bak或其他基因的协调发挥作用．同时我们还发现Bcl-2核酶对肝癌细胞的端粒酶活性有一定的抑制作用，尽管在大多数癌组织中发现端粒酶活化与bcl-2表达下调同时存在，但二者之间是否存在联系尚不清楚．有文献报道．端粒酶活性和细胞周期调控有关，但与bcl-2，p53表达无关[6-8]；也有文献认为，细胞端粒酶活性不仅与细胞周期调控有关，也与bcl-2表达水平存在密切关系[9]．我们的实验结果表明，Bcl-2核酶对细胞端粒酶活性有一定抑制作用，说明bcl-2表达水平的改变有可能影响细胞端粒酶活性，诱发细胞凋亡，提示我们bcl-2与端粒酶相互间的影响在肝癌的发生过程中可能起重要作用，具体机制有待探讨．Bcl-2是肿瘤研究中最受关注的抑制凋亡蛋白，认为其在肿瘤发生中有重要意义，研究发现，bcl-2过量表达可阻断多种刺激引起的细胞凋亡，延长细胞生存期，抑制bcl-2的表达，可以在多种肿瘤中引起细胞凋亡[1-3]。对凋亡调控的研究发现