中国图书馆分类号R735.7

Subject headingshepatitis C virus; envelope protein; protective immune

丙型肝炎病毒(HCV)感染后保护性免疫状况一直是争论的问题．一方面HCV包膜糖蛋白区高度变异和准种的存在，使病毒逃避机体免疫系统识别成为可能；另一方面有研究表明HCV包膜糖蛋白区确实存在中和抗原表位，此表位能诱导机体产生保护性抗体并阻止HCV感染．现就HCV包膜糖蛋白与保护性免疫的关系作一综述.

1HCV包膜糖蛋白的中和抗原表位

已知黄病毒和瘟病毒的包膜蛋白免疫接种动物后均能诱导机体产生保护性免疫，提示与基因疏水图相似的HCV包膜糖蛋白可能是机体免疫攻击的靶目标^［1］．通过基因分析HCV包膜糖蛋白由gp35和gp70组成，分别与牛腹泻病毒的gp25和gp53相对应而牛腹泻病毒的gp53能刺激机体产生中和抗体，此抗体能中和病毒感染，对动物产生保护作用^［2,3］．此外HCV gp70的高变区-1(HVR1)与HIV-Ⅰ型的gp120 V3环相似，而HIV-Ⅰ型gp120 V3环含有诱导机体产生中和抗原表位，此表位产生抗体在体外能中和HIV感染．由此推测，位于HCVgp70中的HVR1可能含有中和抗原表位^［2，3］.

通过分析发现，HCV包膜糖蛋白区确实存在中和性表位，但各家报道意见不一致．Weiner et al^［2］经体外抗体——表位定位研究显示有5个中和抗原表位，位于396～414氨基酸之间，并证实HVR1是体液反应的主要靶位．Kato et al^［3］用体外转录翻译表达HVR1(27aa)融合蛋白与患者血清在体外作免疫沉淀反应，结果提示HVR1含有线性B细胞表位，位于394aa～404aa和397aa～407aa间．此表位能诱导机体产生特异性抗体，但有株特异性(isolate-specific)．Rosa et al^［4］结合细胞荧光标记与流式细胞记数技术，建立了HCV E2蛋白与靶细胞中和结合定量分析检测系统，结果显示HCV E2区至少存在两个中和抗原表位，分别位于HVR1区和E2其他区域．Esumi et al^［5］用相应重组蛋白/合成肽免疫小鼠产生抗血清，在体外基于抗体-病毒相互作用，通过免疫沉淀法研究发现抗E2和抗HVR1能有效地捕获HCV，而且抗E2和抗HVR1能特异性凝集HCV，并指出免疫决定簇主要位于HVR1序列起始20个氨基酸间即384aa～403aa．另外对HVR1 B细胞表位的描述还包括有400aa～409aa^［6］，398aa～410aa^［7］，399aa～405aa^［8］等，近年来也有研究表明E1E2复合体上构型表位的形成对包膜糖蛋白诱导机体产生保护性免疫起重要作用.

2包膜糖蛋白抗体体外阻断HCV感染的研究

一般来说，清除病毒建立机体保护性免疫通常与针对病毒包膜蛋白上中和抗原表位的抗体产生有关，这种抗体既可阻止病毒对敏感细胞的吸附，又可增加细胞免疫对病毒的识别和清除作用．日本学者Shimizu et al^［9］对慢性HCV感染者随访14a，收集不同病程时期的血清在体外与不同HCV分离株混合后接种于培养细胞(感染5a内的血清与初期感染分离株即H77/感染后13a分离株即H90混合).

发现感染早期血清与H77株结合，抑制病毒吸附到敏感的T淋巴细胞(HPB-Ma细胞)，阻止H77株在HPB-Ma细胞中复制，却不能阻断H90株感染；同样用感染后14a的血清(H91)与H77/H90株混合后接种于HPB-Ma细胞，发现H91血清能阻断H90株在细胞中复制，却不能阻断H77株．结果表明HCV感染后确实能诱导抗病毒抗体产生，但这些抗体仅与最近的病毒株发生中和反应，可能是在机体的免疫压力的作用下HCV包膜糖蛋白区基因发生了漂移，使产生新的突变株逃避先前抗体的识别．为了进一步探索抗-HVR1的中和作用．Shimizu et al^［7］合成了与HCV-H77株HVR1区的相一致多肽(即390aa～414aa)，免疫兔后获得抗血清在体外与H77/H90株混合后接种于HPB-Ma细胞，发现抗血清能中和同源性病毒株即H77，却不能中和异源性病毒株即H90株，而对照兔血清对H77株和H90株均无阻断作用，作者认为抗HVR1在体外确实能中和病毒并且有株的特异性．Zibert et al^{［10，11］} 用慢性HCV-AD78感染者血清在体外进行中和实验，此血清含有HVR1抗体，发现感染早期血清(感染后1a内)7份血清有5份血清能干扰病毒颗粒吸附到人成纤维细胞上，阻止病毒复制，而感染后期(感染后11a的血清)却不能阻止HCV-AD78感染．提示抗HVR1在体外确实能中和病毒感染，但不能排除其他抗体的参与．作者还发现有15%与HCV-AD78感染无关的血清抗HVR1亦阳性，其滴度甚至达1∶1600，推测并非所有的抗HVR1都具有株的特异性，其中和作用存在部分交叉反应；可能存在两种HVR1特异性抗体，一种是感染早期出现，能阻止病毒吸附靶细胞，另一种可能是在感染过程中针对构型表位的保守氨基酸序列而产生，其中和活性可能缺乏或是非特异性．Rosa et al^［4］用表达在哺乳动物细胞中重组蛋白E2，经纯化后免疫兔产生多克隆特异性抗E2血清，在体外进行中和结合实验，并通过定量分析评价E2中和作用，结果发现高效价抗E2能中和E2结合到靶细胞并阻止HCV感染，同时发现针对HCV-E2 HVR1特异性单克隆抗体也能部分中和E2结合靶细胞，提示抗E2和抗HVR1抗体在体外确实具有中和病毒作用.

HCV感染人和黑猩猩后机体产生免疫力较弱， 为了积极探索其他实验动物对包膜糖蛋白的免疫应答状况，由此，Ahmed et al^［12］以重组蛋白C，E1，E2免疫小鼠，观察小鼠对其产生的体液免疫反应，并用58种合成肽作为抗原行ELISA法检测小鼠产生的抗体，同时与慢性HCV感染者血清中的抗体进行比较．结果发现唯独小鼠对15种合成肽产生免疫应答，且产生的抗体滴度较高，然而慢性HCV感染者血清中未检测其抗体，15种合成肽中11种肽是针对E2区线型表位，表明小鼠针对HCV包膜蛋白能够产生较强的免疫反应，而这种免疫反应与人和黑猩猩不同；同时在预实验中也发现用E2蛋白免疫小鼠产生的免疫血清能够捕捉HCV，提示抗E2在体外具有中和病毒的作用．Nakano et al^［13］用表达HCV-1a株包膜糖蛋白E2的不同区域DNA质粒免疫小鼠，并对小鼠产生E2抗体进行定性定量分析，通过Rosa et al研制的中和结合实验方法筛选出高效价E2抗体，发现高效价E2抗体能凝集HCV表面非共价结合E1E2复合体，作者认为这种高效价E2抗体可作为潜在的中和抗体，在体外具有中和病毒的作用．Lagging et al^［14］也发现HCV DNA疫苗免疫接种BALB/c小鼠后，可诱导BALB/c小鼠产生强烈的体液免疫应答，并将HCV的E1(174aa～359aa)和E2(371aa～742aa)区与疱疹病毒G蛋白的跨膜区和胞质尾区构建成嵌合基因，即假型病毒(VSV/HCV)；然后用同源性HCV分离株的包膜糖蛋白免疫黑猩猩后获得的免疫血清在体外进行中和实验，发现假型病毒不能感染真核细胞，提示E1和E2在假型病毒感染真核细胞中起着重要作用，作者认为用此嵌合基因免疫小鼠后产生的抗体，可作为潜在的中和抗体为探索HCV疫苗提供一种新途径．Robert et al用编码与特异性E2蛋白结合的5个不同的重组E2抗体，并将这些抗体的Fab切割后进行克隆优化筛选，再用这些Fab片段在体外进行中和实验，发现3个Fab片段能与HCV E2结合并抑制HCV吸附到靶细胞上，结果表明优化重组的Fab能与不同病毒株包膜糖蛋白E2结合产生交叉反应．Hebersetzer et al^［15］从2例慢性HCV感染者外周血单核细胞(PBMC)中获得永生淋巴母细胞系(immortal lymphoblastoid cell lines)，此淋巴母细胞分泌人单克隆抗体(HMAbs)，并用表达在真核细胞中E2蛋白与HMAbs在体外进行中和结合实验，结果发现HMAbs：①能识别构型依赖型抗原决定族；②能识别HCV1a和HCV1b抗原；③与病毒颗粒表面非共价结合E1E2复合体起凝集反应；④HCV-Ⅳ感染者的HMAbs在体外显示中和重组E2蛋白结合易感细胞，提示HMAbs在体外具有潜在中和病毒作用.

3包膜糖蛋白在动物体内保护作用研究

大部分宿主在HCV感染后并不能产生稳定有效的免疫，也不能充分阻止新的变异株攻击，但临床和实验研究表明，初次感染HCV后机体可产生一定程度的保护性免疫．Prince et al^［17］报道黑猩猩第二次受到病毒攻击时临床症状较第一次感染时轻，提示体内产生了针对病毒抗原的保护性免疫．Choo et al^［16］用重组痘苗病毒载体在HeLa细胞内表达E1/E2蛋白，经纯化后适量接种7只黑猩猩，其中2只(A组)9mo内接受18次免疫注射，而另5只(B组)仅在0，1，7mo接受3次免疫注射，结果两组黑猩猩体内均产生了相应的E1和E2抗体，但B组抗体滴度明显高于A组；然后，用HCV-Ⅰ株攻击，结果B组未发病，A组发病但病情较轻，而对照组4只动物全部发病且病情较重，表明该重组蛋白具有一定的保护作用，可用来预防HCV感染．Farci et al^［18］对一慢性HCV感染者随访14a，收集不同病程时期的血浆并将其灭活与不同病毒株混合后对黑猩猩进行接种，观察HCV感染者体内是否存在中和抗体．结果发现H79血浆(感染后2a的血浆)与H77分离株混合后接种黑猩猩均未发生感染，而H90血浆(感染后13a的血浆)与H77分离株混合后接种黑猩猩全部发生感染，表明HCV感染后，确实能产生中和性抗体，对动物有一定的保护作用，但此抗体有株的特异性，作者认为在HCV慢性感染者体内有HCV准种和特异性中和抗体的存在．Farci et al^［19］用HCV-H77株HVR1的两条合成肽(A：390aa～414aa，B：384aa～414aa)免疫接种兔后得到抗HVR1的超免疫血清，然后给5只黑猩猩接种抗血清与不同相似株(H77/H99株)混合物，结果显示抗HVR1仅对同源的H77株攻击有免疫保护作用，而对异源性病毒株H90无免疫保护作用．因此作者认为中和抗体攻击的靶位是E2/NS1的HVR1，但宿主产生的这一保护性免疫应答较弱，而且抗HVR1的