中国图书馆分类号R735

Subject headingsp16 gene; gene mutation; homozygous deletion; LOH; digestive system neoplasms

p16基因又称多重肿瘤抑制基因1(MTS1)、细胞周期素依赖激酶4的抑制物(cyclin dependent kinase 4 inhibitor,CDK4I)或CDKN2，是新近发现的一个重要抑癌基因，与许多肿瘤的发生、发展关系密切．与p53基因相比，它具有突变率高、分子量小，易于标定的特点，因而很快成为肿瘤分子生物学、分子遗传学等学科的研究热点．目前，人们已从基础及临床诊治等多个角度对p16基因进行了研究．本文旨在综述p16基因与消化系肿瘤发生、发展的关系及p16基因治疗情况.

1p16基因的作用及其机制

细胞周期的转换受控于一组细胞周期素(cyclin)蛋白，不同的细胞周期素通过与相应的CDK在细胞周期的特异位点组装成复合物，使细胞内Rb蛋白磷酸化失活并释放转录因子E2F，使细胞由G₁期进入S期而增殖．细胞周期素D与CDK4有特别的亲和力，细胞周期素-CDK4复合物可磷酸化Rb蛋白而使细胞进入增殖状态．P16蛋白为CDK4特异性抑制剂，通过与细胞周期素D-CDK4复合物紧密结合或与CDK4结合竞争性地阻断细胞周期素-CDK4复合物的形成，维持Rb蛋白非磷酸化状态，阻止细胞从G₁期进入S期，抑制细胞增殖^［1］．Hannon et al^［2］发现P16蛋白还用同样方式抑制与CDK4结构功能相似的另一个激酶CDK6的作用．因此，当p16基因发生改变而表达异常时，失去对CDK4及CDK6的抑制作用，导致CDK4及其同类物的活性增强，细胞周期的转换失控，细胞非正常增生、肿瘤形成.

2p16基因失活机制

p16基因及其产物改变已在许多肿瘤细胞株中发现，包括恶性胶质瘤、黑素瘤、白血病、胰腺癌、食管癌、骨肉瘤、膀胱癌、乳腺癌、肺癌、星形胶质瘤，头颈部肿瘤及生殖系肿瘤．据统计，75%的癌细胞株有p16基因缺失或突变，其中突变率在30%～80%不等^［1］．基因失活机制可能包括以下几个方面．①基因缺失：目前有关于p16基因发生杂合性缺失(LOH)的报道，但其主要的灭活方式为纯合性缺失(homozygous deletion)．在大多数人类恶性肿瘤中，纯合性缺失的比率明显高于LOH及突变．②基因突变：包括无义突变、移码突变、断裂或转录抑制突变及小片段缺失．③5＇CpG岛异常甲基化：有研究表明，在原发性膀胱移行上皮癌中有67%的肿瘤标本及细胞系查到p16基因CpG岛甲基化．在一组非小细胞肺癌中，p16基因结构似乎正常但检测不到P16蛋白，这是由于5＇CpG岛被多部位甲基化，从而阻碍了P16转录.

3P16与消化系恶性肿瘤

3.1食管癌Liu et al^［3］分析了15株人食管癌细胞系，发现有10株存在p16基因第1、2外显子同时缺失．Igaki et al^［4］报道人食管癌细胞株P16纯合性缺失率高达93%，并用PCR-SSCP和DNA测序法，分析了原发性食管癌p16基因外显子2的结构变化，结果16%的原发性食管癌出现p16基因外显子2突变．Mori et al^［5］检测27例原发性食管鳞癌中p16基因，有14例(52%)突变，其中8例为移码突变，6例为错义突变．Klump et al^［6］采用甲基化特异性PCR检测p16基因启动子区CpG岛过甲基化情况，并分析了Barrett食管发育不良程度与P16启动子甲基化的关系，发现高度发育不良的标本75%存在启动子过度甲基化，低度发育不良为55.6%，无发育不良者仅2%，认为p16基因启动子过甲基化是导致Barrett食管向肿瘤发展的重要机制．Xing et al^［7］报道食管癌p16基因启动子区CpG岛过甲基化高达50%(17/34)．上述研究表明，p16基因的灭活与食管癌的发生发展关系密切，其灭活途径有点突变、纯合性缺失和5＇CpG岛甲基化．但Busatto et al^［8］对20例原发性食管鳞癌的研究发现无1例发生外显子1、2有突变，仅1例在外显子3非编码区存在G→C、C→T突变；所有标本均可检测到P16蛋白，说明不存在纯合性缺失及过度甲基化，认为p16基因在食管鳞癌的发生、发展中并未起重要作用.

3.2胰腺癌Liu et al^［9］报道50%的胰腺癌细胞株有p16基因外显子1和2的纯合性缺失，30%的胰腺癌细胞株含有p16基因点突变和微缺失(microdeletion)．Naumann et al^［10］对胰腺癌p16基因进行结构分析，结果10例(46%)存在p16及p15同源性缺失，10例(53%)无p16基因转录本，总缺失突变率为56%，提示p16基因对CDKs抑制失常在胰腺癌的生物学中发挥了重要作用．Naka et al^［11］用免疫组化检测了32例患者胰腺癌中P16蛋白表达情况，结果13例(40.6%)P16蛋白阴性，并发现P16蛋白缺失与临床分期及预后明显相关，存活期超过3a的5例患者均无P16蛋白缺失，认为p16基因失活可能是胰腺癌发生的较晚期事件，可能与胰腺癌的进展和转移有关，并且P16的分子生物学分析有助于预后诊断．Whelan et al^［12］分析了家族性胰腺癌的p16突变，发现普遍存在295密码子的G-T替换引起的Gly93Trp突变，认为p16基因的失活参与了胰腺癌的发生机制．由此可见，p16基因失活在胰腺癌发生、发展中发挥了重要作用.

3.3胃癌P16与胃癌的关系目前研究较少，且无一致结论．Akama et al^［13］报道8株胃癌细胞系中有2例存在p16及p15同源性缺失，5株细胞系无P16蛋白表达．吕有勇et al^［14］报道5株胃癌细胞系有一株细胞发生纯合性缺失，三株细胞表达水平下调．PCR分析了85例新鲜实体瘤标本，14例存在p16基因缺失，Southern杂交分析26例中有6例存在p16基因缺失，认为p16基因缺失与胃癌发生、发展有密切关系．Takaoka et al^［15］则报道23例原发性胃癌外科标本无1例存在外显子1和2的突变，RT-PCR检测13例胃癌组织均没有发现有表达下调，提示p16基因异常可能与胃癌发生无关．Wu et al^［16］报道胃癌标本p16基因外显子的同源性缺失率仅10%(6/60)，认为p16基因同源性缺失在肠型胃癌的形成过程中作用有限.

3.4大肠癌Herman et al^［17］研究了结肠癌与5＇CpG岛甲基化的关系，结果提示结肠癌细胞系中有92%(12/13)存在p16基因5＇端CpG岛从头甲基化，40%(8/20)的原发性结肠癌和16%(1/6)的原发性结肠腺瘤有5＇端CpG岛的甲基化，且CpG岛甲基化与p16基因转录缺失有关，认为对于结肠癌，甲基化可能是p16基因唯一的失活机制．Ahuja et al^［18］检测47例结直肠癌的p16基因CpG岛甲基化作用，发现有微卫星序列不稳定(MI)的肿瘤中，甲基化的频率和程度(60%)均明显高于无MI的肿瘤(20%)，提示启动子区甲基化作用与DNA修复不足而引起基因不稳定性有关.

3.5肝癌Biden et al^［19］分析了23例原发性肝癌和4株肝癌细胞系p16基因改变情况，发现无1例有外显子1、2、3的同源性缺失，SSCP发现4例肿瘤存在密码子148突变，其中1例还有密码子119突变，认为p16基因在肝癌的发展过程中未起重要作用．但Matsuda et al^［20］用免疫组化技术检测了60例肝癌的p16基因，发现29例完全无P16蛋白表达，其中24例肿瘤p16基因高度甲基化，60%～85%的CpG岛甲基化，而在P16蛋白弱阳性的肿瘤中甲基化＜25%，P16蛋白阳性的肿瘤无甲基化，说明甲基化程度与p16基因表达程度明显相关，并认为广泛的CpG岛甲基化可能是肝癌中p16基因失活的主要机制.

消化系肿瘤p16基因改变有两个特点．其一，细胞株中缺失突变率要比在原发性肿瘤中高得多，大概有如下原因：①原发性肿瘤中可能混有一定量的正常组织，导致肿瘤组织被正常组织污染；②也可能是细胞在体外培养时，p16基因丢失所致；③也可能存在技术上的差异，不同的检测手段所得结果可能不一样．其二，在组织差异上，食管癌和胰腺癌中存在高频率的突变缺失，对这些肿瘤的发生发展可能起到重要作用．但在胃癌中缺失突变率很低，在结肠癌及肝癌中p16基因极少出现突变或缺失，主要表现为启动子区CpG岛甲基化．在小肠肿瘤中p16基因的变异尚无报道．因此p16基因在胃肠道肿瘤发生、发展中的作用和失活机制，尚有待作更多的探索和研究.

4p16基因与基因治疗

p16基因分子量小，利于导入、重组和标记，在用于肿瘤的基因替代治疗上有十分广阔的前景．目前p16基因治疗主要用于肺癌、间皮瘤、卵巢癌、膀胱癌及头颈部肿瘤，在消化系肿瘤中应用较少．Poulos et al^［21］以p16基因转染人成胶质细胞瘤细胞系，有77.5%发生了G₁-S期阻滞．在人的肺癌、食管癌、肝癌、间皮瘤、卵巢癌等多株细胞系中转染P16的cDNA后均有生长抑制作用．Rocco et al^［22］用腺病毒载体携带p16基因转染人头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)，体外实验显示明显地抑制了细胞的生长，体内实验也取得了较好的结果.

p16基因是新近发现的一种肿瘤抑制基因，其结构改变与多种肿瘤的发生、发展关系密切．但其在细胞系和原发性肿瘤中缺失和突变率的差异不容忽视，有关p16基因在消化系肿瘤中的作用的机制尚需进行全面、深入地研究，为肿瘤的诊断、预后评估及基因治疗提供新的途径.

通讯作者余文林

参考文献

1 Marx J．New tumor suppressor may rival p53．Science，1994;264:344-345

2 Hannon GJ，Beach D．p16^INK4B is a potential effector of TGF-β-induced cell cycle arrest．N