摘要目的探讨过氧化物诱导人类肝细胞(L02细胞)凋亡时重要细胞信使Ca²⁺和同期细胞膜超微结构变化特点和意义，以及丹参提取物有效成分之一Rxa通过Ca²⁺信号系统介导的细胞保护效应.方法实验以正常L02细胞为对照(L¹组)，分Rxa处理组(LaH组，Rxa 2 mmol/ L)和未处理组(LH组)，在H₂O₂ (10 μmol/ L)作用于L02细胞0，0.5，1，2，4，6，8 h，用膜联蛋白荧光素(Annexin-V-Fluos)、碘化丙啶(PI)双标记流式细胞术(FCM)与荧光显微镜联合检测术分析各检测点正常细胞、早期凋亡(Annexin-V⁺)细胞、死亡(PI⁺)细胞指数，用Fura-2/ AM标记全细胞膜片钳放大系统显微荧光检测术同步分析同期Ca²⁺流变化，用扫描电镜技术观察同期细胞膜超微结构变化.结果LH组L02细胞在H₂O₂作用后0.5 h出现Ca²⁺跃升，1 h［Ca²⁺］i＞400 nmol/ L后出现Ca²⁺振荡现象；2 h～4 h荧光显微镜下可观察到细胞凋亡早期膜翻转现象，电镜下可见少量膜小泡出现；4 h～6 h后FCM检测到Annexin-V⁺细胞指数增高，［Ca²⁺］i增大了一个数量级，电镜下可见芽泡形成，8 h后不仅Annexin-V⁺细胞指数大量增加，而且PI⁺细胞指数增加，细胞膜变形，皱缩. 相比较LaH组［Ca²⁺］i及Annexin-V⁺，PI⁺细胞指数均较未处理组为低(P＜0.01)，H₂O₂作用于L02细胞8 h［Ca²⁺］i尚未＞400 nmol/ L，细胞膜结构相对较好.结论H₂O₂可诱导L02细胞Ca²⁺依赖性细胞凋亡；Rxa能有效降低［Ca²⁺］i，发挥抗细胞凋亡和膜保护效应.

中国图书馆分类号R 575

Cytoprotective effects of Rxa in inhibiting apoptosis induced by H₂O₂ via regulating Ca²⁺ proton flux in cultured human hepatocytes L02 cell line

LU Qi-Ping¹, WU Zai-De², LI De-Zhong¹ and TIAN Lei²

¹Department of General Surgery, Chinese PLA, Wuhan General Hospital of Guangzhou Command Area, Wuhan 430070, Hubei Province, China

²Department of General Surgery, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030, Hubei Province, China

AbstractAIMTo evaluate the cytoprotective effect of Rxa, a kind of extract of Radix salviae miltiorrhizae (RSM), in inhibiting apoptosis induced by H₂O₂ via Ca²⁺ signal pathway in cultured human hepatocytes L02 cell line.METHODSL02 cells were divided into three groups. ① control group (L group); ② Rxa pre-treated group (LaH group, Rxa 2 mmol/ L, H₂O₂ 10 μmol/ L); and ③ Rxa non-treated group (LH group, H₂O₂ 10 μmol/ L). The indexes of normal cells, earlier apoptotic cells (Annexin-V⁺ cells), and necrotic cells (PI⁺ cells) were measured with flow cytometry (FCM) combined with fluorescence microscopy; the intracellular free calcium concentration (［Ca²⁺］i) was measured with amp combined with single cell microfluorescence ［Ca²⁺］i measurement, and the morphological changes of cell membrane surface untrastructure was observed by scanning electron microscopy during the periods of Rxa and/ or H₂O₂ incubated with L02 cells for 0，0.5, 1, 2, 4, 6, 8 hours.RESULTSThe increase of ［Ca²⁺］i and Ca²⁺ spiking induced for 0.5 h in LH group, and Ca²⁺ oscillation of L02 cells appeared for 1 h when ［Ca²⁺］i＞400 nmol/ L, probably; the early phenomenon of PS transformation was showed for 2 h-4 h; and the ［Ca²⁺］i and index of Annexin-V⁺ cells increased for 4 h-8 h significantly; the membrane protuberance, budding and atrophy were observed subsequently. By contrast, ［Ca²⁺］i and index of Annexin-V⁺ cells in LaH group were all lower than that in LH group (^aP＜0.01, ^aF=245.30; ^bP＜0.01,^bF=72.12), the membrane injury was also weaker in that one.CONCLUSIONH₂O₂-induced apoptosis in L02 cells is mediated through an increase of ［Ca²⁺］i; Rxa has cytoprotective effect, which may relate to its effect of calcium blocking.

Subject headingsapoptosis; Ca²⁺; Rxa; L02 cell; Radix salviae miltiorrhizae

0引言

为探讨丹参提取物之一Rxa通过Ca²⁺信号系统介导的抗细胞凋亡的肝细胞保护效应，我们应用膜联蛋白荧光素(Annexin-V-Fluos)、碘化丙啶(PI)双标记流式细胞术(flow cytometry, FCM)与荧光显微镜联合检测、Fura-2/ AM标记膜片钳放大系统联合显微荧光测定术、扫描电镜技术同步观察H₂O₂诱导人类正常肝细胞(L02细胞)凋亡时不同时限Ca²⁺流变化、细胞膜超微结构变化和Rxa的影响，报告如下.

1材料和方法

1.1材料人类L02细胞(购自武汉大学细胞保藏中心)RPMI/ 1640培养基(含100 mL/ L胎牛血清，1×10⁵ U/ L青霉素，100 mg/ L链霉素，2 mmol/ L谷胺酰氨，Gibco公司)传代培养. 以生长稳定的第3～5代细胞制备细胞悬液，接种于12孔板，每孔细胞数5.2×10⁹/ L. 孔池内置2片0.5 cm²经多聚赖氨酸处理的小玻片. 实验以正常L02细胞为对照(L组)，分为Rxa处理组(LaH组，Rxa 2 mmol/ L分别与L02细胞共同孵育2 h后置入H₂O₂ 10 μmol/ L)和未处理组(LH组，仅置入相同剂量H₂O₂)，37℃ CO₂培养箱内孵育0，0.5，1，2，4，6，8 h后分别收集细胞进行有关项目检测. 各重复5次.

1.2方法

1.2.1细胞凋亡测定收集各检测点细胞，PBS洗涤，1000 rpm 5min，将细胞悬浮于100 μL含Annexin-V-Fluos和PI的双标记液中(Gibco公司，U.S.A)孵育15min，加0.4 mL孵育液(NaCl 140 mmol/ L， CaCl₂ 5 mmol/ L，HEPES，10 mmol/ L， pH=7.4)，用FACSort流式细胞仪(BD公司，U.S.A) CELL Quest软件分析各类细胞指数，正常细胞、早期凋亡细胞(荧光显微镜下呈绿色荧光的Annexin-V⁺细胞)和死亡细胞(红色荧光的PI⁺细胞)分别被FACSort定量，每次测定10 000个细胞. 同时取每一检测点细胞悬液50 μL，应用Olympus (Japan)荧光显微镜观察细胞形态.

1.2.2单细胞游离钙浓度(［Ca²⁺］i)测定将附有细胞的小玻片置于培养皿内，PBS洗涤，加入标准细胞外液0.5 mL，与Fura-2/ AM(1.25 μmol/ L)37℃ CO₂培养箱共同孵育30min，应用EPC-9型计算机全自动化膜片钳放大器(HEKA，Lambert, Germany)及显微荧光测钙系统(Carl Zeizz, Inc. Germany)测量单个活细胞内R值(R=F1/ F2，即340 nm/ 380 nm波长激发F的荧光强度值)和［Ca²⁺］i. 每组测定10个细胞. 实验数据经X-Chart软件和IGOR Pro软件(Germany)分析处理.

1.2.3细胞膜超微结构观察取出另一片附有细胞的小玻片，放入25 g/ L戊二醛溶液中固定4 h，常规制备电镜制片，用S450扫描电镜(日立公司，Japan)观察细胞膜超微结构.

统计学处理应用SAS计算机软件系统进行基本统计量计算，方差分析F检验.

2结果

LH组H₂O₂作用后0.5 h L02细胞出现Ca²⁺跃升，荧光显微镜及FCM检测未发现Annexin-V⁺细胞增多和细胞指数增高；作用后1 h，L02细胞［Ca²⁺］i大于400 nmol/ L时出现Ca²⁺振荡现象，个别细胞［Ca²⁺］i高达1396.3 nmol/ L；作用后2 h，荧光显微镜下可见到散在的Annexin-V⁺细胞即细胞凋亡早期膜翻转现象，表现为细胞呈透明气球状，胞膜为一绿色光环；光镜下细胞变圆，胞膜透亮；电镜下可见部分细胞有小泡状突起. 此后［Ca²⁺］i持续增高，FCM检测Annexin-V⁺细胞指数相应增大，此时［Ca²⁺］i上升了一个数量级，电镜下膜小泡增多，并可见细胞皱缩和芽泡现象，6 h后可见到在Annexin-V⁺细胞中有PI向胞质渗透，8 h后Annexin-V⁺和PI⁺细胞指数均显著上升，荧光显微镜下可见胞质或胞核红染的PI⁺细胞. 光镜下多数细胞形态失常，电镜下可见细胞皱缩变形. 相比较LaH组L02细胞［Ca²⁺］i显著低于同期