摘要目的如何应用激光扫描共聚焦显微镜的Lasersharp软件进行分子共存分析.方法使用Bio-Rad公司的Lasersharp软件分析肝癌和胃组织细胞中不同分子的共存.结果仔细进行样本制备和图象采集才能得到分子共存的可靠结果. 所有抗体应严格设立对照，确保抗体的特异性，并无交叉反应. 同时进行两个分子荧光标记，应使用间接荧光标记技术. 荧光素的发射波长应无重叠，如用Alexa488和丽丝胺罗丹明或Texas Red. 发射滤光片应达到可最大采集，同时又避免与其他荧光素发射光谱的相互渗透. 通常应用的一对荧光素是FITC和TRITC或FITC和Texas Red. 用抗体和共聚焦显微镜进行共存研究时根据激光光源的差别分别选用不同的荧光素. 当荧光素的发射光谱存在相互渗透时，应分别采集不同荧光素标记的图象. 使用氪/氩激光进行图象采集时，注意仔细平衡激发强度，即使在同时激发的情况下，也可得到充分光谱分离的图象.结论在图象采集时避免光谱渗透，并从所有图象中去除背底染色后，Lasersharp共存分析软件包可提供正确的共存系数.

中国图书馆分类号R 57

Molecular co-localization analysis with the software of laser scanning confocal microscope in digestology

WANG Chun-Mei

Department of Electromicroscopy,

PAN Bo-Rong

Room 12, Building 621,

FENG Lei

Central Laboratory, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, Shaanxi Province, China

HUANG Xiao-Feng DAI Xiao-Wen LI Zhen-Jiang

Department of Pathology, Chinese PLA 117 Hospital, Hangzhou 310013, Zhejiang Province, China

AbstractAIMTo analyse the molecular co-localization with Lasersharp software of laser scanning confocal microscope in digestology.

METHODSMolecular co-localization analysis of liver cancer and stomach tissues was performed with Lasersharp software of laser scanning confocal microscope (Bio-Rad Company).RESULTSReliable results can be obtained by sufficient careful sample preparation and acquisition. All antibody controls should be established to ensure antibody specificity and no cross reactivity between antibodies. When two molecules are being labelled immunofluorescently, the indirect technique should be used. Fluorochromes should have well separated emissions, e.g., Alexa 488 and Lissamine rhodamine or Texas red. Emission filters should be optimized to maximize emission collection whilst avoiding bleed-through from other fluorochromes. Different fluorochromes should be selected in the molecular co-localization analysis. Sequential image was collected when bleed-through is present. With a Krypton/ Argon laser, careful balancing of the excitation intensities will produce images with sufficient spectral separation even in simultaneous mode.CONCLUSIONThe Lasersharp software co-localization package can provide valid coefficients if bleed-through is avoided during acquisition and background staining is subtracted from all images.

Subject headingslaser scanning confocal microscope; software; digestology; molecular co_location

0引言

在生物学意义上，共存指的是两种或两种以上的分子精确的存在于同一空间位置. 这些分子通常是蛋白质分子，可通过荧光标记的相应抗体或探针进行观察. 在进行两种分子共存的研究中，可用绿色荧光抗体标记一种分子，用红色荧光抗体标记另一种分子. 这样任何共存的部位都可显示出黄色或橘色的荧光. 如标本相当薄，用普通荧光显微镜可进行明确的共存程度的评价. 然而，如果标本厚于几微米，就要鉴别这些黄色或橘色的光点是来自同一平面的同一位置呢，还是来自于不同平面的光点垂直重叠上去造成的. 共聚焦和多光子显微镜可很好地解决这一问题.

大多数共聚焦显微镜输出的是由多维体素(Voxel，计算机轴向体层摄影时所扫描的每一象素的体积单位)排列构成的数字信号. 在同一标本的同一部位，一种分子和另一种分子的共存可表示为图象上的体素或在某一特定水平上绿色荧光强度和另一特定水平上红色荧光强度.

1材料和方法

1.1材料肝癌和胃组织取自解放军117医院，为手术切除标本，经常规福尔马林固定，石蜡包埋后切片，厚5 μm. 所用抗体购自Dako公司和Sigma公司.

1.2方法

1.2.1免疫组织化学染色按文献［1］描述方法进行.

1.2.2标本制备和图象采集为可靠的确定共存的程度，应仔细进行样本制备和图象采集. 另外，在随后的图象分析中还要应用样本制备的知识. 应当清楚，如果在样本制备和图象采集时，不充分注意，软件可能生成误导的数值和图象. 以下各点应充分考虑.

1.2.2.1抗体对照所有抗体对照均应严格观察. 若同时进行两个分子荧光标记，提示应该应用间接荧光标记技术，这一技术可增强特异性同时可有信号放大作用. 如有共存或在下述情况下，可出现黄色或橘色的图象：①在两种被检测的分子的抗体存在交叉反应. 因此，进行任何共存的研究前，应进行一系列的未标记或单标记对照以评定交叉反应. ②若第一抗体分子与其他蛋白而不是目标蛋白分子相互作用，也可导致蛋白定位错误. 使背底染色过深而引起分析更为困难. ③荧光素的发射光谱重叠也可引起假阳性结果.

1.2.2.2荧光素选择应尽可能选择发射光谱重叠可能性最小的荧光素. 这是因为绿色的发射光谱和红色的发射光谱可能相互的渗透(bleed-through)，因此可能引起标本上的一些并非有共存的点出现橘色的图象. 两种荧光素中较明亮的一种更易产生渗透现象. 若使用的绿色荧光素的发射光谱较窄，而红色的发射光谱在红色甚至是远红外的区域，则可获得最好的标 记结果. 在标记操作时应注意确保两种荧光探针(fluorophores)有相似的亮度. 应用普通的表面荧光进行检查时，由于人眼对远红外光的不敏感，因此在使用远红外滤光片时有一定的局限性. 这使得凭视觉进行评价十分困难. 因此，大多数使用者倾向于常规应用的一对荧光素是FITC和TRITC(它们的光谱重叠较小)或FITC和Texas Red(它们发射光谱极少重叠). 共聚焦显微镜激光的使用，因为用于观测的是探测头而不是人眼，使得绿色荧光素和远红外荧光素的联合应用成为可能，而且光电倍增管对远红外光更为敏感. 如要观察发射远红外光的荧光素，应考虑应用共聚焦显微镜. 免疫学上应用的发射远红外光线的荧光素不多，一种是Cy5，另一种是allophycocyanine(别藻蓝蛋白). 而且需要红色激光［氪/氩激光，(红色的氦氖Red HeNe)激光或红色二极管(Red diode)激光］. 用抗体和共聚焦显微镜进行共存研究时最好的荧光素组合是：①氩离子激光：Alexa 488或Cy2+Cy3［r-phycoerythrin(藻红蛋白)是最好的，它可以穿透组织到达目标］. 假如TRITC染色足够强的话也可使用Cy2和TRITC. ②氪/ 氩激光：Alexa 488+Lissamine rhodamine(丽丝胺罗丹明)或TRITC，或Texas Red+Cy5. ③氩+绿色氦氖(Green HeNe)激光：Alexa 488或Oregon green或BODIPY-FL+Lissamine rhodamine(丽丝胺罗丹明)或XRITC. ④氩+红色氦氖(Red HeNe)激光：Alexa 488+Cy5. ⑤氩+绿色氦氖(Green HeNe)激光+红色二极管(Red Diode)激光：Alexa 488+Lissamine rhodamine(丽丝胺罗丹明)+Cy5. 若一种探针是标记细胞核的，你可以有更多的选择权，如选7-aminoactinomycin-D(氨基放线菌素D)，其激发波长为543或568 ηm，发射波长为655 ηm.

1.2.2.3图象采集除非你选择的两种荧光素的发射光谱没有重叠，否则只能用断续模式进行图象采集. 如使用的是氪/ 氩激光，仔细平衡激发强度，即使在同时激发的情况下，也可得到充分光谱分离的图象. 正常情况下，可迅速根据图象进行共存评价：若所有各点同时既有红色，又有绿色，可能是交叉反应引起. 假如有明显的绿色点，红色点，也有明显的黄色点，可能有共存现象. 如果用断续模式进行图象采集，在分别采集绿色和红色荧光信号时，应注意将增益(gain)设定到保证红色和绿色荧光信号强度相等，并且在饱和度(saturation)之下. 同样地，black水平应调节至足以去除背底噪音. 总之，确保抗体的特异性，并无交叉反应；荧光素的发射波长应无重叠，如用Alexa 488和Lissamine rhodamine(丽丝胺罗丹明)或Texas Red；发射滤光片应达到可最大采集，同时又避免与其他荧光素发射光谱的相互渗透；当荧光素的发射光谱存在相互渗透时，应分别采集不同荧光素标记的图象.

1.2.3进行共存分析的理论LaserSharp3.0版及其以后的版本含有共存分析功能. 程序可计算出一幅双色图象中代表共存部分的两个数值. 这些值称为共存系数(co-localisation coefficient)^［1］. 这一计算是根据Pearson相关系数得出的，该系数用于描述图象<