摘要目的为探讨HSP70在人胃癌中过度表达的意义，调节HSP70在人胃癌细胞系SGC7901中的表达.方法应用脂质体介导的基因转染方法，将表达针对HSP70的反义RNA表达载体及HSP70表达载体转入SGC7901细胞，通过hygromycine抗性筛选，挑选阳性克隆；对阳性克隆从RNA水平(点杂交及RNase保护试验)及蛋白质水平(Western blot及免疫组化)进行研究.结果HSP70在转染细胞中的表达得到了调节. 为进一步研究HSP70对胃癌形成与发展的作用创造了条件.结论经过HSP反义或正义RNA转染的SGC7901细胞具有不同的HSP70表达水平可用于胃癌发生机制的研究.

中国图书馆分类号R 735.2

Regulation of HSP70 expression in human gastric cancer cell line SGC7901 by gene transfection

GUO Jian-Cheng¹, LI Ji-Chang², FAN Dai-Ming¹, QIAO Tai-Dong¹ and ZHANG Xue-Yong¹

¹Digestive Disease Institute of Chinese PLA, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, Shaanxi Province, China

²The 1st Teaching Hospital of Henan Medical University

AbstractAIMTo regulate the expression of HSP70 in human gastric cancer cell line SGC7901 for clarifying the role of HSP70 in carcinogenesis of human gastric cancer.METHODSAn antisense RNA to HSP70 expressing vector pBBS212/ as-hsp70 and a sense RNA to HSP70 expressing vector pBBS212/ HSP70 were constructed and transfected into human gastric cancer cell line SGC7901 via lipofectamine mediated transfection. The clones of transfected cells were selected with hygromycine. The expression of HSP70 in the transfected cells was evaluated at mRNA level (dot blotting and RNase protection assay) and protein level (Western blotting and immunohistochemical staining).RESULTSThe expression of HSP70 was successfully regulated in different transfected cells, up-regulated in pBBS212/ hsp70 transfected group and down-regulated in pBBS212/ as-hsp70 transfected group.CONCLUSIONThe cells expressing different levels of HSP70 can be used for further studies concerning the role of HSP70 in carcinogenesis of human gastric cancer.

Subject headingsheat shock protein; stomach neoplasms; transfection

0引言

HSP70是体内含量最多的分子伴侣^［1］，资料显示HSP70与一些肿瘤的产生与发展有关^［2-4］. 我们发现，HSP70在人胃癌组织中过度表达^［2］，为探讨HSP70对人胃癌产生与发展的作用，我们通过在人胃癌细胞系SGC7901细胞中转染针对HSP70的反义RNA表达载体pBBS212/ as_hsp70和HSP70表达载体pBBS212/ hsp70的方法调节了HSP70在胃癌细胞株SGC7901中的表达，作为进一步研究的基础.

1材料和方法

1.1材料针对HSP70的反义RNA表达载体pBBS212/ as-hsp70和HSP70表达载体pBBS212/ hsp70的构建.

1.2脂质体介导基因转染将处于对数生长期的SGC7901细胞用胰酶消化后，加入6孔板中，每孔2 mL，含3×10⁵细胞，继续培养约12 h～16 h使达到80%融合. 用无抗生素的无血清RPMI1640培养液洗涤细胞，待转染、 在无菌条件下配制A液(100 μL无血清RPMI1640培养液+质粒DNA 2 μg)，B液(90 μL无血清RPMI1640培养液+10 μL lipofectamine). 将A，B两液混合，置室温下反应30min，使脂质体充分包裹质粒，之后加入不含血清及抗生素的RPMI1640至2 mL，轻轻混匀并滴加到洗过的细胞中. 37℃，50 mL/ L CO₂培养6 h后更换为含100 mL/ L FBS的RPMI1640液继续培养，48 h～72 h后进行Hygromy_cine抗性筛选.

1.3Hygromycine抗性克隆的挑选及扩增在显微镜下选出生长状态良好的hygromycine抗性克隆，并作好标记. 弃去培养基，以克隆环蘸取少许凡士林，分隔细胞克隆，向克隆环中滴加胰酶消化3min～5min，吸去消化液，以少许培养基吹吸克隆，然后转入24孔板内以含hygromycine的培养基培养，待孔底长满后，转入培养瓶扩增培养.

1.4Hygromycine抗性克隆Hsp70表达的研究1.4.1RNA水平的研究①斑点杂交：RNA变性、点样、预杂交及杂交、放射自显影. 取已定量的RNA样品，分别加入2倍体积的100%甲酰胺，0.7倍体积的370 g/ L甲醛，0.2倍体积的20×SSC，混匀后置68℃水浴15min，迅速置冰水中冷却，点样. 放于80℃烤箱烤2 h. 将点好RNA样品的膜用6×SSC浸湿放入塑料袋中，加预杂交液12 mL，封口后置于68℃中水浴2 h. 取出杂交袋，向预杂交液中加入探针，重新封口，在68℃中温育16 h～24 h. 取出杂交膜在不同浓度SSC溶液中反复漂洗，取出NC膜，放射自显影. ②RNase protection assay:细胞RNA 10 μg，加³²P 1.0×10⁵min^-1标记的单链寡核苷酸探针；无水乙醇、glycogen 25 μg(终浓度25 mg/ L沉淀体积)、1/ 10体积3 mol乙酸钠，-20℃放置20min；离心沉淀；800 mL/ L乙醇洗涤；加30 μL甲酰胺杂交buffer重悬；85℃ 10min，迅速置37℃，过夜；加RNase S buffer及RNase S 2 U(Promega公司)，37℃消化60min；乙醇沉淀；加20 μL100 g/ L SDS，2.5 μL 20 g/ L蛋白酶K，37℃ 15min；酚/氯仿抽提；乙醇沉淀(加1 μL 10 g/ L yeast tRNA,1 mL沉淀体积)；真空干燥；重溶于5 μL～10 μL RNA上样缓冲液［800 mL/ L formamide, 1 mmol/ L EDTA pH 8.0，1 g/ L bromphenol blue, 1 g/ L xylene cyanol］；配制电泳凝胶；采用18%变性聚丙烯酰胺凝胶(可根据探针长度调整丙烯酰胺浓度)；电泳，1 xTBE电泳缓冲液；8 V/ cm，120min；放射自显影.

1.4.2蛋白质水平的研究①免疫印迹(Western blotting)：三去污法制备细胞总蛋白样品. SDS-PAGE电泳及电转移. 免疫学检测. 简要如下：取含相同含量的蛋白的样品，加入5×SDS凝胶加样缓冲液，沸水中煮5min，然后点于凝胶上样孔，同时设标准分子量蛋白对照. 电泳. 在4℃下以60 V恒压转移约8 h，将蛋白转移至NC膜上. 加封闭液15 mL/ L BSA，配制于洗涤液)，于37℃作用1.5 h后，弃之. PBS洗膜3×10min. 加入鼠抗人Hsp70 mAb(Stress Gen公司，1∶4 000稀释)，于37℃孵育1 h后，弃之. PBS洗膜3×10min. 加入HRP标记的马抗鼠IgG(Vector公司，1∶800稀释)，37℃温育1 h，弃之. PBS洗膜3×10min. 加入含DAB的底物溶液，显色，拍照. ②免疫组织化学染色：细胞爬片经3 mL/ L过氧化氢封闭内源性过氧化物酶30min，1 mL/ L马血清孵育40min后加抗HSP70(1∶3000)，4℃过夜. 次日加马抗鼠生物素化二抗(1∶100)，37℃，30min；ABC复合物，37℃，30min. 之后用DAB显色. 以上各步骤除血清孵育后甩干血清直接加一抗外，均间以PBS三遍洗涤. 阴性对照以PBS代替一抗，阳性对照为已知HSP70阳性的人脑组织标本.

2结果

2.1RNA水平研究点杂交显示，应用针对HSP70反义mRNA的探针进行杂交时，从转染pBBS212/ as-hsp70的细胞中提取的RNA出现杂交信号，其他细胞无杂交信号(图1a).

而应用针对正义HSP70 mRNA的探针进行杂交时，各组细胞中的RNA均出现杂交信号，其中转染pBBS212/ s-hsp70的细胞中的RNA的杂交信号增强，而转染pBBS212/ as-hsp70的细胞中杂交信号降低(图1b).

图1a应用针对热休克蛋白反义RNA ³²P标记的探针在不同细胞RNA斑点印渍：泳道1，SGC7901细胞；泳道2，经pBBS212/ as-hsp70转染的SGC7901细胞；泳道3，经pBBS212/ hsp70的SGC7901细胞；仅转染了pBBS212/ as-hsp70细胞RNA出现杂交信号.

1b应用针对热休克蛋白正义RNA ³²P标记的探针在不同细胞RNA斑点印渍：泳道1，SGC7901细胞；泳道2，经pBBS212/ as-hsp70转染的SGC 7901细胞；泳道3，经pBBS212/ hsp70的SGC7901细胞，泳道4,对VCR耐药的SGC 7901细胞；仅转染了pBBS212/ hsp70的和对VCR耐药的SGC7901细胞的RNA杂交信号增强.

RNA Protection Assay显示，应用针对HSP70反义RNA的探针与细胞RNA杂交后，转染了pBBS212/ as-hsp70的细胞出现了阳性信号，而其他细胞则无(图2a)；应用针对HSP70 mRNA的探针与细胞RNA杂交后，转染pBBS212/ hsp70的细胞中的RNA的杂交信号增强(图2b).

图2a核糖核酸酶保护试验. 应用针对HSP70反义RNA^32P标记<