中国图书馆分类号R573

摘要

目的了解和分析中国幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)菌株细胞毒素相关基因A(cagA)的核苷酸序列特性.

方法从两位患胃溃疡儿童的胃粘膜中分离两株Hp菌株，用PCR方法扩增cagA基因的5端和3端的两个片段并作克隆和序列分析.

结果两株中国Hp菌株cagA基因之间的同源性为94%～95%. 中国Hp菌株与国外菌株相同区段比较，5端的同源性为89%～92%，3端的同源性为69%.

结论中国Hp菌株与国外Hp菌株cagA基因5端序列部分区域的同源性较好，可以作为分子检测Hp感染的靶基因序列，而cagA基因3端序列部分区域的同源性较差，可以作为Hp分子流行病学研究的靶基因序列.

Cloning and characterization of Hp cagA gene sequences derived from Chinese strains

ZHONG Ping¹, WU Kun-Xiang¹, XU Fan-Hong¹, XU Chun-Di² and XU Jia-Yu²

¹Laboratory of Diagnostic Reagents, Shanghai Institute of Biological Products, Shanghai 200052, China

²Shanghai Ruijin Hospital, Shanghai 200025, China

Subject headingsHelicobacter pylori infection; cagA; gene cloning; cagA gene; sequencing

Abstract

AIMTo investigate the sequence characterization of Hp cagA gene from Chinese strains.

METHODSTwo Hp strains derived from two Chinese pediatric patients with gastric ulcer were isolated. Two DNA fragments of Hp cagA gene 5 and 3 regions of each strain were PCR-amplified, cloned and sequenced.

RESULTSThe nucleotide homology between two Chinese Hp strains was 94%. However, the nucleotide homology of cagA gene 5 and 3 regions between Chinese and American strains and between Chinese and Italian strains were 89% and 69%-71%, respectively.

CONCLUSIONThe nucleotide sequences of Hp cagA gene 5 region among the strains showed a better homology, this region could be chosen as a target gene for molecular diagnosis of Hp infection, while that of cagA gene 3 region between Chinese and American strains or between Chinese and Italian strains showed a poorer homology, this region could be chosen as a target gene for Hp molecular epidemiological study.

0引言

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)是消化性溃疡和慢性胃炎的主要致病因子，并与胃癌的发生有密切关系. 目前国外已经发表了近10个Hp菌株cagA基因的全序列，然而中国Hp菌株的cagA基因的序列还未见报道. 为此，我们从中国患胃溃疡儿童胃粘膜中分离了两株Hp，进行分子克隆和分析了它们的cagA基因中的两个片段的核苷酸序列，为中国分子诊断Hp感染和进行Hp的分子流行病学研究奠定基础.

1材料和方法

1.1材料胃粘膜组织取自于上海第二医科大学瑞金医院儿科两位胃溃疡儿童. Hp分离培养基：培养基成分为：Campylobacter Agar Base 43g/L(OXOID)，奈啶酸20mg/L(Sigma),TTC 40mg/L (F.M.K.)，万古霉素6mg/L(Sigma)，两性霉素B2mg/L(Sigma)，100mL/L新鲜羊血. pMAL-C2购自于美国Biolabs公司，pSP72和大肠杆菌JM109由本所分子生物学研究室提供. 限制性内切酶和T4 DNA连接酶(Boehringer Mannheim), Taq plusⅡ DNA聚合酶(上海Sangon公司)，T7测序试剂盒(Pharmacia)，α-³⁵S-dCTP(Amersham). Hp cagA 5端核苷酸序列片段的PCR扩增引物(cagA基因157nt～504nt)：P1(上游引物)：5-CCGGAGAATTCGATAACAGGCAAGCTTTTGAGG-3；P2(下游引物)：5-GCCTGCAGTAATCGAAAAGA_TTGTTTGGCAG-3；Hp cagA 3端核苷酸序列片段的PCR扩增引物(cagA基因2269nt～2877nt)：P3(上游引物)：5-GCGGATCCAGCAAGGTAACGCAAGC-3；P4(下游引物)：5-GCGTCGACTTATCGCCCTACTTCACTGA_GATC-3. 引物由上海Sangon公司合成.

1.2方法内镜下应用常规方法在胃窦部炎症明显处铗取胃粘膜组织块，接种于选择培养基平板，置37℃微氧环境(50mL/L O₂，70mL/L CO₂，80mL/L H₂和800mL/L N₂)下培养5d. Hp基因组DNA的制备参照文献［1］中的方法. PCR扩增cagA基因5端和3端片段：PCR反应体积为50μL，其中包括主要试剂0.3μmol/L引物，1.5mmol/L Mg^2＋，0.5U Taq DNA聚合酶. PCR反应条件：94℃ 4min预变性；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，共35个循环；72℃延伸10min. DNA片段纯化、质粒连接和细菌转化参照文献［2］方法进行. DNA序列测定和分析采用Sanger双脱氧链终止法测序. 采用电脑DNA分析辅助软件对所测得的DNA序列进行同源性分析.

2结果

2.1PCR扩增cagA基因片段5端片段PCR片段扩增产物长度为340bp，与预期的核苷酸长度相符合；3端片段PCR扩增产物的长度为700bp，比预期的长度604bp长.

2.2测序质粒的构建PCR扩增的Hp cagA基因5端片段和3端片段分别经EcoRⅠ, pstⅠ和BamHⅠ, SalⅠ双酶切反应后分别定向插入于载体pMAL-C2和pSP72中，得到四个测序重组质粒如pMA1, pMA2, pSB1和pSB2. 它们的双酶切反应后的片段与预期的核苷酸长度结果相符合.

2.3Hp cagA基因5端和3端部分核苷酸序列和同源性分析Hp cagA基因5端部分核苷酸序列中，两株中国Hp菌株(SH21和SH9)之间的最大同源性为94%～95%，它们与美国和意大利Hp菌株核苷酸之间的最大同源性为89%～92%(图1). Hp cagA基因3端部分核苷酸序列中，两株中国Hp菌株(SH21和SH9)之间的最大同源性为94%，而它们与美国和意大利Hp菌株核苷酸之间的最大同源性为69%(图2).

10 2030 405060

Hp(A) GATAACAGGC AAGCTTTTGA GGGAATCTCG CAATAAAGGG AAGAATACTC CAATAAAGCG

Hp(I) ******************** A*************T***** ********** **********

Hp(21) ******************** **A**********CT***** ********G* **********

Hp(9) ******************** **A**********CT***** ********G* **********

70 8090 100110120

Hp(A) ATCAAAAATC CTACCAAAAA GAATCAGTAT TTTTCAGACT TTATCAATAA GAGCAATGAT

Hp(I) ************************************************************

Hp(21) ***********C************************************************

Hp(9) ***********CG***********************************************

130 140 150 160 170180

Hp(A) TTAATCAAGA AAGACAATCT CATTGTCGTG GAATCTTCCA CAAAGAGCTT TCAGAAATTT

Hp(I) ********C*********** *****AT**A******************** **********

Hp(21) **G*****C*********** *****CT**A**T******GT*G******* *A********

Hp(9) **G*****C*********** *****CT**A**T******GT*G*T***** *A********

190200 210 220 230240

Hp(A) GGGGATCAGC GTTACCGAAT TTTCACAAGT TGGGTGTCCC ATCAAAACGA TCCGTCTAAA

Hp(I) ************************************************************

Hp(21) ****************A******T**G*************T******A************

Hp(9) ****************A******T**G*************T******A************

250260 270 280 290最大同源性

Hp(A) ATCAACACCC GATGCATCCG AAATTTTATG GAACATACCA TACAACCCCC TATCCCT

Hp(I) *************CG******************A***T*****************T* 96%

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