主题词

中国图书馆分类号R735

Subject headingsdigestive system neoplasms/therapy; suicide gene; gene therapy

在恶性肿瘤的各种基因治疗中，自杀基因(suicide gene)/前药(prodrug)系统备受关注. 目前已在多种肿瘤进行大量临床前研究，有的已进入Ⅰ/Ⅱ期临床试验. 该疗法对消化系肿瘤的治疗作用，业已得到证明^［1］. 不管哪一种自杀基因/前药系统，均需有下列3个成分：①能编码一种酶的自杀基因：该基因通常来源于病毒或真核细胞，其编码的酶能将无毒的前药转变为活性毒物，引起靶细胞死亡；在缺乏前药的条件下，该种基因的表达对机体无害；该基因编码的酶对基质(前药)应具有高度催化效能(高Kcat)^［2］. ②基因转移载体(gene-transfer Vectors)：为了转移自杀基因至靶细胞，一般采用基因工程改造的逆转录病毒(retroviruses)、腺病毒(adenoviruses)和腺病毒相关性病毒(adenovirus-associated viruses)作为载体^［3］. 也有人采用阳离子脂质体作为载体，发现其对内皮细胞有高度亲和力^［4］. 基因转移的关键是其靶向性(targeting)^［5］. 如将甲胎蛋白(AFP)启动子和清蛋白增强子(Alb)TRS连接自杀基因，则后者便仅于表达AFP的肝癌细胞中表达，而不影响正常肝细胞^［6］. ③能被自杀基因编码的酶作用的前药(prodrug)：这种前药在自杀基因不存在时，对机体无毒或仅有微小毒性，而在自杀基因编码的酶特异性作用下，前药转化为活性药物，后者的细胞毒性较无活性的前药至少强100倍.

1自杀基因/前药系统

1.1单纯疱疹病毒1型胸腺嘧啶激酶/戊环鸟苷(HSV-tk/GCV)系统表达单纯疱疹病毒1型胸腺嘧啶激酶(herpes simplex virus-1 thymidine kinase, HSV-tk)的小鼠成纤维细胞，对戊环鸟苷(ganciclovir, GCV)的敏感性较野生型细胞强1000倍，在BALB/c小鼠，给予GCV，可使表达HSV-tk的肉瘤和Abelson白血病病毒性淋巴瘤完全退缩. 上述发现奠定了HSV-tk/GCV系统的基础. GCV本身无毒性，在HSV-tk作用下，变成GCV单磷酸盐(GCV-MP)，再经内源性细胞激酶作用，迅速转化为其二磷酸-(GCV-DP)和三磷酸盐(GCV-TP)，后者对增殖中的哺乳细胞具有高度毒性. 虽然哺乳动物细胞胸腺嘧啶激酶也能催化GCV的转化，但HSV-tk的作用比其强200倍. GCV-TP具有羟基，能插入DNA链中，引起碱基配对错误、DNA断裂、姐姝染色单体交换和致死性基因失稳定^［7］；GCV-TP尚能抑制DNA聚合酶，进一步阻止DNA合成^［8］. 在暴露于GCV后，表达HSV-tk的哺乳动物细胞内迅速聚集GCV磷酸盐，而未表达HSV-tk的野生型细胞则无GCV磷酸盐测得；将HSV-tk转染的细胞与³H标记的GCV一起孵育，发现放射性标记物迅速而稳定地掺入细胞DNA内. 应用IH核磁共振分光镜检测，发现肿瘤组织在HSV-tk/GCV治疗后，含胆碱物质的显性弥散系数减少50%，而迅速弥散性水成分的显性弥散系数增加219%，细胞内粘滞度明显增加，而大分子物质的流体动力学面积可能减少^［9］；动力学分析显示细胞内P53蛋白水平先增加，继之cyclin β1蛋白水平升高，细胞周期中止于S/G₂^［10］. 上述事实说明HSV tk/GCV引起肿瘤细胞凋亡. HSV-tk/GCV系统不仅能杀灭表达HSV tk的细胞，且具有显著的旁观者效应(bystander effect, BSE).

无论是体外抑或体内实验均观察到，GCV剂量越大，培养中的HSV-tk⁺细胞被杀灭的比例和肿瘤退缩率也越高，荷HSV-tk⁺瘤的动物生存期也越长. 至于HSV-tk本身的表达水平，一般与对GCV的敏感性不具有相关性，但不完全如此. 此外，细胞对HSV-tk/GCV的敏感性尚取决于担负着GCV二-和三磷酸化的细胞激酶的活性、细胞增殖速率以及将GCV-TP整合入DNA的DNA聚合酶活性^［11］. 有人认为，GCV被HSV-tk⁺细胞摄取较慢，亲和力较差，不是很理想的HSV-tk基质^［12］. Balzarini et al^［13］发现，Elaidic acid ester GCV(E-GCV)的代谢物在HSV-tk⁺细胞内停留时间较GCV代谢物长1倍以上，且E-GCV在血浆中较GCV稳定，因此如用作HSV-tk系统的前药，其作用至少比GCV强10倍；Tong et al^［14］发现，如果用无环鸟苷(acyclovir, ACV)代替GCV作为前药，并使用较GCV常用剂量高2.5～5.0倍的剂量，则引致的旁观者效应明显高于应用GCV作为前药时.

1.2带状疱疹病毒胸腺嘧啶激酶/阿糖甲氧基嘌呤(VZV-tk/Ara-M)系统与HSV-tk不同，带状疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(varicella zoster virus thymidine kinase， VZV-tk)对GCV亲和性甚弱，而对前药阿糖甲氧基嘌呤(6-methoxypurine arabinside, Ara-M)和溴乙烯基脱氧尿嘧啶(E)-5(2-bromovinyl)-2＇-deoxyuridine ,BVdU)具有亲和力，能选择性催化二者磷酸化，再在细胞内酶作用下，最后生成三磷酸盐，分别为Ara-ATP和BVdU-TP^［15］. 野生型细胞对高达1500μmol/L浓度的Ara-A和75μmol/L～250μmol/L浓度的BVdU均不敏感，而对表达VZV-tk的细胞，低至1μmol/L～100μmol/L浓度的Ara-M和0.06μmol/L～0.6μmol/L的BVdU即呈细胞毒性^［16］.

1.3胞嘧啶脱氨酶/5氟胞嘧啶(CD/5FC)系统胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase, CD)系由大肠杆菌和某些霉菌表达的一种酶，不存在于哺乳动物细胞内，能催化胞嘧啶生成尿嘧啶. 抗霉菌药5氟胞嘧啶(5-fluorocytosine, 5FC)经CD脱氨后，生成5氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5FU)，再经细菌内酶作用，生成氟脲嘧啶三磷酸盐(5-fluoro-5＇-trip hosphate)和氟脱氧尿嘧啶单磷酸盐(5-fluoro-2＇-deoxyuridine-5＇-monophosphate, FdUMP). 后二者抑制胸苷酸合成酶(thynidylate synthase)，阻抑DNA，RNA和蛋白合成，引致细胞死亡. 一般选用大肠杆菌的CD基因作为自杀基因. 应用5FC作为前药，有不少优点，例如，人的细胞酶不能使5FC脱氨，因此在通常剂量下5FC几无毒性；口服吸收良好(＞80%)；能透过血脑屏障等^［1］. 表达CD的哺乳动物的细胞在暴露于5FC后. 细胞内迅速产生可测定水平的5FC，胸苷酸合成酶受抑，广泛形成RNA皱缩物(RNA adduts). 由CD/5FC介导的细胞死亡发生较HSV-tk/GCV引起者为慢^［17］，可能由于5FC被摄取和转化较慢所致. 但CD/5FC引起的细胞杀死作用不一定弱于HSV-tk/GCV，主要由于前者往往有更强的旁观者作用. 如同HSV-tk/GCV一样，前药5FC的细胞毒性作用也呈现剂量相关性，在某些敏感的细胞系如结肠癌，细胞毒性与CD表达呈正相关^［18］，但在对5FU不敏感的肉瘤细胞，此种相关性不明显，看来，细胞毒作用的强弱可能最终取决于特殊细胞系对5FU的内在敏感性. CD/5-FC系统也显示旁观者效应，与HSV/GCV时相似，但机制不同^［19］.

1.4细胞色素P450微粒体酶CYP2B1/环磷酰胺(CYP2B1/CPA)系统自大鼠肝分离出的细胞色素P450微粒体酶CYP2B1，能催化化疗药环磷酰胺(CPA)和异环磷酰胺(IFF)，生成4羟环磷酰胺(4HC)，再迅速转化为短寿命的烷基化物磷酰胺氮芥(phosphoramide mustard)，引致细胞DNA损伤. 在体内，转染CYP2B1基因的细胞对CPA的敏感性较野生型细胞高15倍～20倍. 该系统具有中等强度的旁观者效应. 该系统对累及某些特殊部位如脑、脑膜的肿瘤可能具有特殊作用. CPA能自由地透过血脑屏障，但CPA转化为4HC主要发生于肝内，而4HC不易透过血脑屏障. 如将CYP2B1基因转导入脑瘤内，再给予CPA，则局部生成的4HC可对脑瘤发挥细胞毒作用. 在进行自身骨髓移植的肿瘤患者，可利用CYP2B1/CPA清除骨髓内瘤细胞. 4HC对正常造血细胞和肿瘤细胞均有毒性，如将表达CYP2B1的腺病毒载体转染骨髓，由于造血细胞缺乏腺病毒表面受体，因此仅有肿瘤细胞被CYP2B1基因有效地转染，从而被毒性4HC杀灭，而正常造血细胞不受危害^［1］.

1.5细胞色素P450 CYP4B1/氨基蒽(CYP4B1/2AA)系统免细胞色素P450 CYP4B1能选择性作用于前药氨基蒽(2-aminoanthracene, ZAA)或4-ipomeanol (4-IM)，使之转化为活性物质烷化剂不饱和性或乙醛呋喃环氧化物(aldehyde furan epoxide^［20］). 此种活化药物在很低浓度即显示高度DNA毒性. 体外实验表明，只要有1%的细胞表达CYB4B1，即有显著的旁观者效应.

1.6脱氧胞苷激酶/阿糖胞苷(dCK/Ara-C)系统临床上发现，抗白血病的核苷酸类药物如阿糖胞苷(Ara-C)、2-氯脱氧腺苷(2CdA)和fludarabine的效应与白血病细胞表达脱氧胞苷激酶(deoxycytidine kinase, dCK)的水平相关. 这些前药在细胞内活化的关键步骤是被dCK磷酸化. Ara-C虽为造血系统恶性肿瘤的有效药物，但对实体肿瘤作用有限. 人dCK能将Ara-C在细胞内磷酸化，使其细胞毒性增加. 有人用逆转录病毒或腺病毒，将dCK基因转染至神经胶质瘤细胞，使这些瘤细胞对Ara-C敏感性明显提高^［21］.

1.7乌苷-黄嘌呤磷酸核糖基转移酶/6-硫黄嘌呤(gpt/6TX)系统大肠杆菌的乌苷-黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(guanosine-xanthine phosphoribosyl transferase, gpt)基因表达产物，既能增强被转染细胞对硫黄嘌呤的敏感性，也能增强对mycophenolic acid、黄嘌呤和次嘌黄嘌呤的抗性，从而可对被转染细胞进行正、负选择. gpt能使6-硫黄嘌呤(6-thioxanthine, 6TX)和6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine, 6-TG)磷酸化，增加转染gpt基因细胞对该两种前药的敏感性. 鼠神经胶质瘤细胞被逆转录病毒转染gpt基因后，对6-TX的敏感性提高50倍～100倍.^［22］. 给予无胸腺鼠颅内C6肿瘤内移植gpt-逆转录病毒载体产生细胞，