中国图书馆分类号R735.7

摘要

目的比较DC对诱导4d(L-4)和诱导7d(L-7)的LPAK细胞体外杀伤人肝癌细胞株BEL-7402(B)的杀伤力和杀伤模式的影响.

方法L4组为B+L-4，LD4组为L4组+DC；L7组为B+L-7，LD7组为L7组+DC. L-4和L-7与B的效靶比均为5∶1和10∶1两种. 采用杀伤细胞检测技术及电镜技术，比较各组的杀伤效应和杀伤模式.

结果各组的细胞毒活性为LD4＞L4(P＜0.01)，LD7＞L7(P＜0.01). L4组和LD4组的BEL-7402细胞呈现不同程度的变性坏死，L7组和LD7组的BEL-7402细胞则呈现不同程度的凋亡改变.

结论DC对不同诱导时间的LPAK细胞体外杀伤肿瘤细胞都有明显的促进作用，但并不改变LPAK细胞对肿瘤细胞的杀伤模式.

0引言

IL-2加PHA诱导的LPAK(lymphokine and PHA activated killer)过继免疫疗法较单用IL-2活化的LAK细胞在增殖能力和细胞毒活性方面有所增强，临床应用也取得一定疗效，但尚未有突破性的进展. 而应用树突状细胞(dendritic cell, DC)进行抗肿瘤免疫的研究，特别是在提呈肿瘤抗原和激发CTL活性方面的研究，已取得了长足的进展^［1］. 我们比较了诱导4d和诱导7d的LPAK细胞，在DC的辅助下对人肝癌细胞株BEL-7402体外杀伤力及杀伤模式如下.

1材料和方法

1.1材料人肝癌细胞株BEL-7402引自中山医科大学实验动物中心. 人外周血单个核细胞由健康青年志愿者捐赠. Percoll分离液为Pharmarcia公司产品. rhIL-2由南京军区军事医学研究所惠赠，PHA为广州工业研究所产品，人IgG和Ficoll分离液购自上海华美公司. 人外周血DC的分离按本室常规^［2］，将人外周血单个核细胞悬液经不连续Percoll密度梯度分离并收集35%～50%界面层细胞，37℃培养36h后，置于IgG包被的培养皿中用panning法纯化. 收集的非粘附细胞即为高度富集的DC. LPAK细胞的诱导：调整人血单个核细胞浓度为2×10⁹/L，加入IL-2 1000kU/L和PHA20mg/L，分别于37℃，50mL/L CO₂，饱湿条件下孵育4d和7d. 其中7d者孵育期间半保留换液扩增1次.

1.2方法①抗肿瘤实验：实验按诱导4d的LPAK细胞(L-4)和诱导7d的LPAK细胞(L-7)分为两大组，每一大组又分成4个实验组. L-4大组：L4组为BEL-7402(B)+L-4，其中B的浓度8×10⁷/L，L-4与B的效靶比为5∶1和10∶1两种；LD4组为相应的L4组+DC，DC的浓度为8×10⁶/L. L-7大组：各分组中除将L4改为L7外，其余均与L-4大组相同，即分为两种效靶比的L7组和相应的LD7组. 另设未经任何处理的B组(BEL-7402对照组)和培养液空白对照组. 每组均设3个复孔，置含100mL/L新生牛血清的RPMI-1640培养液内，于96孔平底培养板中37℃，50mL/L CO₂，饱湿条件下培养48h后进行效应细胞的细胞毒活性检测. 实验重复4次. ②中性红摄入比色法检测LPAK的细胞毒活性：在上述培养细胞内加入中性红溶液并温育1h，再加入盐酸—乙醇溶液，于BIO-RAD3550-UV型全自动酶联检测仪上以570nm波长测各孔的吸光度A，用GB-STAT统计软件对实验数据进行方差分析. ③电镜样品的制备：取各组离心沉淀细胞，常规固定、脱水、包埋，超薄切片，电子染色，日立H300型透射电镜观察、摄片.

2结果

2.1DC对诱导LPAK细胞的细胞毒活性中性红摄入比色法检测和统计结果表明，L4，LD4和L7，LD7组各自的细胞毒活性均随效靶比的增高而增强(P＜0.01). 而在同一效靶比条件下，各组的细胞毒活性为LD7＞L7，LD4＞L4(P＜0.01，图1).

2.2DC对诱导LPAK细胞的杀伤模式对照组B组的BEL-7402细胞微绒毛丰富，细胞核大而圆，染色质分散，细胞质电子密度较低(图2). 实验组L-4和L-7大组中，不仅在DC与LPAK，LPAK与BEL-7402细胞之间，而且在DC与BEL-7402细胞之间都存在着细胞突起与微绒毛、或微绒毛与微绒毛的犬牙状交错接触(图3，4). 在L4组和LD4组中，BEL-7402细胞呈现不同程度的变性坏死. 细胞膜破裂，细胞轮廓不清，细胞肿胀；细胞核形态不一，有的核肿胀，有的核固缩；细胞质内细胞器明显破坏，内质网扩张，线粒体肿胀、嵴溶解消失，并可见髓鞘样小体(图5). L4组和LD4组的坏死细胞在形态上无明显差别. 在L7组和LD7组中，BEL-7402细胞则呈现不同程度的凋亡改变. 凋亡细胞的形态多样，有典型的改变，如细胞膜微绒毛消失；细胞核移位，染色质或凝聚、浓缩成新月形、弧形边集于核膜下，或固缩成团块状，或碎裂成小块、碎块被内质网包裹形成自噬体；细胞质浓缩，线粒体皱缩变小；浓缩的细胞碎片还向细胞外出芽隆起形成凋亡小体等. 也有不典型的改变，如细胞核核膜虽于核孔处断裂，但核染色质浓缩边集形成“菜花状”；细胞质内肿胀的线粒体中，有的内含致密体，有的嵴紊乱、断裂、甚至空泡化，但遗留嵴的痕迹；内质网或增生肥大，或出现不同程度的退行性变，甚至肿胀空泡化；而细胞器界膜和细胞膜一般保持完好(图6，7). L7组和LD7组的凋亡细胞在形态上无明显差别.

图1DC对诱导LPAK杀伤活性的影响.

图2对照组BEL-7402细胞微绒毛丰富，核大而圆，染色质分散，核仁清晰可见，细胞质电子密度低，细胞器完好. ×5000

图3LD4组DC的突起与BEL-7402细胞膜紧密接触. ×10000

图4LD7组DC的突起与BEL-7402细胞的微绒毛呈犬牙状交错接触. ×5000

图5LD4组BEL-7402细胞呈明显的坏死改变. ×7000

图6L7组BEL-7402细胞呈明显的凋亡改变. ×5000

图7LD7组BEL-7402细胞呈明显的凋亡改变. ×10000

3讨论

本实验表明DC对不同诱导时间的LPAK细胞体外杀伤肿瘤细胞都有明显的促进作用，但并不改变LPAK细胞对肿瘤细胞的杀伤模式. 我们认为，DC之所以能增强LPAK细胞的杀伤效应，固然与其表面有大量树枝状突起，使之有利于直接接触肿瘤抗原并提呈给LPAK细胞有关^［1］；也与其能分泌多种细胞因子有关^［3］；而更重要的则与其可以通过MHCⅠ类分子途径将外源性抗原提呈给CD8⁺细胞，同时还提供充分的共刺激信号的功能密切相关^［4］. 此外，最近又发现DC能通过分泌或外排一种具有抗原提呈能力的小体(exosomes)来诱导免疫反应，这无疑也增强了LPAK细胞的抗肿瘤功能^［5］.

至于肿瘤细胞的死亡模式，我们认为应取决于LPAK细胞本身. LPAK细胞是一个异质性的细胞群体，诱导4d的LPAK细胞亚群以表达CD16⁺，CD8⁺和CD3^-的细胞特征为主，而诱导7d的LPAK细胞亚群则主要表达DC16^-，CD8⁺和CD3⁺的CTL细胞特征^［6］. 诱导4d的LPAK细胞亚群所含的穿孔素在肿瘤细胞膜上打孔后，向肿瘤细胞内释放溶解素，甚至全部胞质，直接溶解肿瘤细胞，使之崩解、坏死^［7］. 而诱导7d的LPAK细胞亚群虽然也分泌穿孔素，并在肿瘤细胞膜上形成孔道，但因该细胞亚群含有大量的细胞毒性颗粒，因此穿孔素协助了细胞毒性颗粒进入靶细胞，其中颗粒酶B在穿孔素的协助下，能快速进入靶细胞并诱导DNA降解导致凋亡；而颗粒酶A，则因其反应较慢而诱导凋亡晚期的DNA片段化降解；还存在的颗粒酶C，D，E，F，G，可能也参与晚期的杀伤机制^［8，9］. 此外，7d的LPAK细胞膜上的纤维连接蛋白也与凋亡的发生密切相关^［10］. 在现有应用LPAK细胞的临床治疗中，采用诱导7d的LPAK细胞为好；若先以自体外周血DC体外刺激LPAK细胞，再回输体内，可望获得更佳的治疗效果.

作者简介：张锦，女，1943-03-07生，广东省澄海市人，汉族. 1965年南京铁道医学院医疗系本科毕业，教授，硕士生导师，主要从事免疫细胞及其抗肿瘤研究，曾获省部级科技进步二等奖，发表论文48篇.

广东省高教厅自然科学重点资助项目，No.19952901

通讯作者张锦，515031，广东省汕头市新陵路3号，汕头大