摘要

目的应用基因工程方法构建表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)的菌株.

方法用PCR方法从幽门螺杆菌染色体DNA上扩增出UreB基因片段，将其克隆至pSK(+)质粒上，然后插入原核表达载体pET-22b(+)中，在大肠杆菌BL-21(DE3)中表达.

结果经测序UreB片段有1707bp组成，为编码569个氨基酸残基的多肽. SDS-PAGE和免疫印迹分析检测发现，UreB基因表达的蛋白质分子质量为65000U，并证实该重组蛋白质可以被幽门螺杆菌感染阳性患者的血清所识别，同时将其免疫小鼠可刺激机体产生抗该重组蛋白质的抗体.

结论重组的UreB可以作为一种有效的蛋白质疫苗用于幽门螺杆菌感染的预防和治疗.

中国图书馆分类号R573.2

Cloning, expression and

immunogenic of Hp UreB gene

LI Ming-Feng¹, LING Zhen¹, MA Ai-Ying¹, ZHAO Jian-Hua¹, SUN Jian-Xin², YU Sheng-Zhi¹ and WU Xiang-Fu²

Department of Gastroenterology, Chinese PLA 455 Hospital, Shanghai 200052, China

Subject headingsHelicobacter pylori; urease B; cloning; gene expression; immunogeni

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Abstract

AIMTo construct a recombinant strain which could express antigen of UreB subunit from Helicobacter pylori.

METHODSThe gene encoding the structural B subunit of H. pylori urease was amplified from H. pylori chromosomal DNA by PCR. The gene was inserted in the prokaryotic expression vector pET-22b(+), and then was transformed into the BL21(DE3) E.coli strain, expressed UreB recombinant protein.

RESULTSUreB fragments were composed of 1707base pairs, which were encoded polypeptides of 569amino acid residues. Western blot analysis of UreB recombinant protein showed that it can be specifically recognized by the serum of H.pylori-infected patients, and can also be recognized by the serum of immunized Balb/c mice with UreB itself.

CONCLUSIONUreB may be an effective protein vaccine for prevention and treatment of the infection of H.pylori.

0引言

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是当今世界上感染率最高的细菌之一，发展中国家和地区尤甚. 它的感染可引起人体产生胃炎和消化性溃疡，与胃癌的发生密切相关^［1-3］. Hp在我国普通人群中的感染率较高，约50%～80%, 可经口传播. 与居住条件、人口密度、饮食卫生等因素有关. 如何预防和根除Hp感染是目前临床治疗的重点. 免疫疗法有望成为治疗该类感染性疾病的最有效、最有前景的方法之一^［4］. 在Hp的免疫治疗研究方面，应用细菌的超声粉碎抗原、纯化尿素酶(urease, Ure)以及纯化的细胞空泡毒素和热休克蛋白等作为抗原免疫动物均取得了较好的免疫预防和治疗效果^［5-7］. 新近研究发现，尿素酶的亚单位UreA和UreB均能诱导机体产生免疫反应，但UreB产生免疫的反应性更强^［8，9］. 我们对UreB的目的基因进行了克隆和表达，为Hp疫苗的进一步研究奠定了基础.

1材料和方法

1.1材料细菌株幽门螺杆菌H.pylori ATCC 43504由上海仁济医院消化病研究所萧树东教授惠赠；菌株TG1，BL21(DE3)，质粒pSK(+),质粒pET-22b(+)为中科院上海生物化学研究所吴祥甫教授组保存；Balb/c 小鼠购自中科院上海生物化学研究所动物房；T4 DNA连接酶、限制性内切酶、Klenow酶等均购自Gibco BRL公司；Taq DNA聚合酶为MBI公司产品；X-gal，IPTG为Boehringer Mannheim公司产品；羊抗人IgG-辣根过氧化物酶和兔抗鼠IgG碱性磷酸酶均为华美公司产品；患者血清来自解放军455医院内镜室.以患者的胃窦粘膜作尿素酶检测和病理组织切片染色观察是否为Hp感染阳性来筛选血清. 选取Hp感染阳性患者血清10例，正常人血清4例；其余试剂均为进口或国产分析纯.

1.2方法

1.2.1总DNA的提取从固体培养基上刮取适量生长状态良好的Hp菌落，置入100μL无菌去离子水中，制成含菌浓度约为1×10¹⁰个/L的菌液，直接加热煮沸2min，离心取上清置-20℃保存备用.

1.2.2UreB DNA的扩增取Hp总DNA量2μL，按常规PCR条件进行扩增，即94℃变性5min,加入2U的Taq DNA聚合酶，按如下参数循环35次；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，最后一个循环结束后72℃反应10min.

1.2.3重组克隆及DNA序列分析质粒抽提、酶切反应、电泳鉴定、DNA片段回收、连接反应及细菌转化等均参照文献［10］略加修改进行. DNA测序按自动测序方法进行.

2结果

2.1幽门螺杆菌 UreB目的基因根据Labigne et al^［11］报道的UreB DNA序列，经微机分析设计两个引物：P1为5’-GACATATGAAAAAGATTAGCAGAAAAG-3’，P2为5’-GGCTCGAGCTAGAAAATGCTAAAGAGTT-3’. 引物P1为UreB蛋白N端的编码序列，引入起始密码子ATG及Nde I酶切位点；引物P2为UreB蛋白C端编码端的编码序列，引入起始密码子ATG及NdeI酶切位点；引物P2为UreB蛋白C端编码序列的互补序列，并引入一个XhoI酶切位点. 以Hp总DNA为模板进行PCR扩增，产物经1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，可得到一条长约1707bp的DNA扩增产物(图1).

图1幽门螺杆菌UreB DNA扩增产物的琼质糖凝胶电泳

1. 标准分子质量(1kb DNA ladder). 2. UreB DNA扩增产物

2.2UreB基因的克隆及序列分析将PCR产物经Klenow酶补平，与经EcoRV酶切的pSK(+)质粒在T4DNA连接酶作用下，18℃～22℃连接过夜. 然后转化大肠杆菌TG1，通过NdeⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定含有插入片段的重组质粒，挑取2个阳性克隆分别进行测序(图2).

NdeI

GACATATGAAAAAGATTAGCAGAAAAGAATATGTTTCTATGTATGGCCCTACTACAGGCGATAAAGTGAGATTGGGCGATACAGACTTGATCG

CTGAAGTA

MetLysLysIleSerArgLysGluTyrValSerMetTyrGlyProThrThrGlyAspLysValArgLeuGlyAspThrAspLeuIleAlaG

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**

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*

TTCTTGGCTAAAGGTAACGTTTCTAACGATGCGAGCTTAGCCGATCAAATTGAAGCTGGTGCGATTGGCTTTAAAATCCACGAAG

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*

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