摘要

目的研究逆转录病毒载体高效转移并表达于大鼠原代肝细胞.

方法采用表皮生长因子(EGF)刺激大鼠原代肝细胞增殖，以表达β-半乳糖苷酶的双顺反子逆转录病毒载体(pGCEN/β-gal)感染肝细胞. 采用X-gal原位染色方法检测肝细胞内LacZ的表达.

结果肝细胞表达β-半乳糖苷酶基因，转导效率为3%～22%.

结论双顺反子逆转录病毒载体(pGCEN/β-gal)可有效介导β-gal基因表达于原代大鼠肝细胞，提示该载体可用于标记大鼠肝细胞，有利于研究肝细胞移植后在体内的生物学特性和肝病的体外基因治疗.

中国图书馆分类号R575

Retrovirus-mediated transduction of primary rat hepatocyte

LIAO Dan¹, XIE Qing¹, ZHOU Xia-Qiu¹, QIAN Shu-Bing², CHEN Shi-Shu² and LI Ding-Guo²

¹Department of Infectious Diseases, Ruijin Hospital, ²Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025, China

Subject headingshepatocytes; retroviral vectors; gene therapy

Abstract

AIMTo study the efficient and stable transduction of primary cultures of adult rat hepatocytes by replication-defective retrovirus.

METHODSHepatocytes proliferated increasingly by adding epidermal growth factors(EGF). Hepatocytes have been infected with bicistronic retroviral vectors expressing β-galactosidase gene. Retrovirus-mediated transduction was measured by X-gal stain.

RESULTSHepatocytes expressed β-galactosidase gene. Transduction efficiency ranged from 3%to 22%.

CONCLUSIONThe bicistronic retroviral vector could mediate expression of β-galactosidase gene in rat hepatocyte efficiently. The vector could be used as a marker gene in rat hepatocyte and benefit the study of biological characters of transplanted hepatocytes and the in vitro gene therapy in hepatic diseases.

0引言

肝细胞移植可采用基因标记肝细胞以便于追踪研究移植细胞的生物学特性. 由于逆转录病毒载体能有效整合并表达，安全性强，不易引起免疫炎性反应，因此被广泛用于移植肝细胞的基因标记和肝病的体外基因治疗^［1］. 但逆转录病毒载体的感染需要靶细胞处于分裂增殖状态，而原代大鼠肝细胞增殖能力弱，逆转录病毒载体感染效率低，近年来人们采用生长因子刺激肝细胞增殖，取得了较好效果^［1，2］. 我们观察了含血清和EGF的培养条件下，双顺反子逆转录病毒载体介导β-gal基因表达于肝细胞的效率.

1材料和方法

1.1材料Sprage-Dawley ♂大鼠(150g～200g)由上海第二医科大学动物房提供. 培养基M199和DMEM为Gibco公司产品. 胰岛素、地塞米松、转铁蛋白、polybrene, EGF均为Sigma公司产品. 小牛血清(FCS)为杭州四季青公司产品. ³H-TdR购于中科院原子能研究所. 5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷(X-gal)购于华美生物工程公司.

1.2方法

1.2.1肝细胞的分离培养实验动物采用Seglen改良方法进行原位二步灌流，联合Ficoll离心制备纯净的肝细胞^［3］. 用含100mL/L小牛血清(FCS)的M199培养液(含胰岛素10^-8mol/L+地塞米松10^-6mol/L+转铁蛋白5μg/L)制成1×10⁹细胞数/L的细胞悬液，以3×10⁴ cells/cm²的密度接种于35mm Nucc培养皿，置37℃，50mL/L培养箱内培养，4h后换液，将肝细胞分为2组，1组改用含50mL/L的M199培养液(胰岛素10^-8mol/L+地塞米松10^-6mol/L+转铁蛋白5μg/L+EGF 10μg/L). 另1组培养液中不含EGF. 此后每24h换液1次.

1.2.2重组逆转录病毒感染肝细胞逆转录病毒载体pGCEN/β-gal基因含有NeoR(neomycin-resistance)基因和β-gal(β-galactosidase，LacZ)基因，二者受控于同一启动子，结构如图1^［4］. 经pGCEN/β-gal转染的PA317包装细胞包装产生表达β-gal基因的双嗜性逆转录病毒(由上海第二医科大学人类基因治疗研究中心提供). PA317细胞系培养于含100mL/L FCS的DMEM，收集含病毒的培养上清液，用于感染肝细胞. 用NIH3T3测定病毒滴度为10⁹cfu/L. EGF组肝细胞在培养的1d～5d，每天随机挑选3皿，轻轻吸去肝细胞培养液，用PBS洗涤一次，加入病毒上清液1mL和polybrene 8μg，摇匀后继续培养，6h后更换新鲜培养液^［2］. 重复感染组在培养的1d～4d中，1次/d，重复感染4次.

图1双顺反子逆转录病毒载体pGCEN/β-gal结构示意图

1.2.3X-gal染色检测LacZ的表达为了要检测逆转录病毒感染肝细胞内β-gal的活性，肝细胞感染病毒后48h，将欲染色的细胞用含钙、镁离子的PBS洗涤，加入PBS缓冲的福尔马林固定液，固定5min，再用PBS洗涤，加染色液(X-gal浓度为1g/L)，37℃孵育2h～24h^［2］. 显微镜下观察，蓝染细胞为基因转导阳性细胞，随机挑选3视野，采用VIDAS计算机图像处理系统分析计算基因转导效率，计算公式如下：

基因转导效率(%)=蓝染细胞面积/细胞总面积×100%

1.2.4肝细胞DNA合成的测定采用³H-TdR掺入试验反映肝细胞DNA合成状态. 分别在不同的培养时间(1，2，3，4，5d)用含³H-TdR(37MBq/L)的培养液孵育肝细胞5h，以胰酶消化贴壁细胞后，将细胞样品收集于玻璃纤维滤膜上，减压抽滤，于滤膜上依次滴入蒸馏水、50g/L三氯醋酸、无水乙醇，将滤膜烘干冷却后，放入闪烁瓶内加闪烁液(PPO和POPOP)，用液闪仪测定³H-TdR掺入DNA量，结果表示为Bq/10⁴细胞/小时.

1.2.5葡萄糖-6-磷酸酶活性测定取培养2d，6d的肝细胞，按常规方法，用含葡萄糖-6-磷酸钾盐和硝酸铅的孵育液在37℃孵育30min，蒸馏水洗涤2次，加入10g/L硫化铵1min，蒸馏水洗涤，镜下观察细胞显色.

统计学处理数据以±s表示，行t检验和直线相关分析.

2结果

2.1肝细胞的分离培养采用胶原酶体内原位灌洗法联合Ficoll 离心的方法，可分离出(1～2)×10⁸肝细胞，活率达95%. 肝细胞培养3h～4h，细胞贴壁，培养24h，细胞由球形变扁变薄呈多边形，胞质均匀，核清晰，以双核细胞为主，并以多个细胞聚集成簇排列，3d～4d后细胞逐渐生长融合形成单层膜状(图2，3).

图2培养4h肝细胞贴壁，细胞成簇排列 ×10

图3培养24h肝细胞伸展成上皮细胞样，核清晰可见 ×25

2.2原代肝细胞的逆转录病毒转导及LacZ的表达重组病毒载体中β-gal基因(LacZ)来源于大肠杆菌，其编码产物作用于X-gal中的吲哚环而显蓝色，真核细胞中无此基因表达. 因此以蓝染细胞为表达β-gal基因的阳性细胞(图4)；未经重组病毒上清感染的肝细胞组为阴性对照组，对照组未见蓝染. 重组病毒载体对肝细胞的感染效率在前4d逐渐上升，4d达高峰，5d开始降低. 重复感染组染色细胞可达22%±6%(图5).

图4大鼠原代肝细胞表达β-半乳糖苷酶基因的组织化学分析. 肝细胞接种后96h，用重组病毒上清液感染，转导48h后，行X-gal染色，阳性细胞蓝染 ×25

图5逆转录病毒载体感染肝细胞的效率

2.3肝细胞DNA合成通常在体外培养时肝细胞的分裂增殖能力有限，加用生长因子可提高肝细胞的DNA合成能力. 本实验测定了在常规培养条件下加用EGF (10μg/L)时，肝细胞内³H-TdR的掺入，发现在常规培养<