摘要

目的探讨副结核杆菌(Mycobacterium paratuberculosis, Mp)在克隆病(Crohn＇s disease, CD)病因学中的作用.

方法将5例CD患者肠道的活检组织制成匀浆，100μL作PCR分析，40μL接种地鼠肠壁后4mo，作肉眼和组织学观察，炎症程度评分按Tanaka的肠道损伤积分标准.

结果5例CD肠粘膜匀浆中，有2例扩增出Mp 400bp的DNA片段. 用PCR阳性组CD匀浆接种10只地鼠后，有5只出现了肉芽肿性改变，并再次PCR扩增检出了Mp. PCR阳性组肠道损伤平均积分为4.8±2.4；PCR阴性组仅有1只出现肉芽肿性炎症，积分为3.7±1.7，两组无显著性差异(P＞0.05)；而两组动物肉芽肿性肠炎的发病率有显著性差异(P＜0.05)；CD匀浆组和正常肠粘膜组的积分有显著性差异(P＜0.05).

结论Mp确实可能为部分CD的致病菌.

中国图书馆分类号R574

Granulomatous enteritis induced by tissue homogenates of Crohn＇ sdisease in hamsters

MIAO Ying-Lei¹, OU YANG Qin² and GAN Hua-Tian²

¹Department of Gastroenterology, The First Affiliated Hospital of Kunming Medical College, Kunming 650032, Yunnan Province, China

²Department of Gastroenterology, The First Affiliated Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041, Sichuan Province, China

Subject headingsCrohn＇s disease/etiology; mycobacterium paratuberculosis; granulomatous enteritis

Abstract

AIMTo investigate whether Mycobacterium paratuberculosis (Mp) plays an etiologic role in Crohn＇s disease (CD).

METHODSOne hundred μL homogenates of intestinal biopsy tissue from CD patients was analysed by PCR, and 40μL homogenates was inoculated intramurally into the cecum and terminal ileam of each hamsters (n=5), tissues from two inoculated segment of ileum and cecum were obtained and evaluated macroscopically and histologically after 4 months. Each hamster was scored on the criteria for assessment of intestinal damage.

RESULTSTwo of five CD homogenates were positive for Mp. The 5 of 10 hamsters receiving PCR positive CD homogenates developed mucosal ulceration and granulomatous changes. The correct 400bp amplification product was obtained again in the granulomatous intestinal tissues of 5 hamsters inoculated PCR positive CD homogenates when the IS900 PCR was applied. The average score of hamsters intestinal damage induced by PCR negative CD homogenates was 3.7 ±1.7which markedly increased as compared with those of normal gut mucosa group(P＜0.05); but no statistically significant difference was shown when compared with PCR positive CD homogenates group.

CONCLUSION Mp possibly plays an etiologic role in at least some cases of Crohn＇ s disease.

0引言

克隆病(Crohn＇s disease, CD)是一种病因未明的胃肠道慢性炎性肉芽肿疾病. 迄今认为与CD相关的发病因素有感染、免疫、遗传和环境因素等，其中感染因素尤为人们所关注^［1］. 由于分枝杆菌感染宿主后，能引起肉芽肿性炎症，使早期研究者们认为分枝杆菌可能是CD的致病菌，其中有人特别提到了副结核分枝杆菌(Mycobacterium Paratuberculosis, Mp)^［2］，该菌感染反刍动物后，能诱发慢性非干酪样坏死性肠炎，即Johne＇s病. 为此，我们利用CD患者肠粘膜匀浆接种地鼠，观察接种后的病变，以探讨CD与Mp感染的相关性.

1材料和方法

1.1材料取自华西医科大学附属一院1997-01/1998-02到肠镜室检查的CD患者5例，符合1993年全国慢性非感染性肠道疾病学术研究会制定的CD诊断标准^［3］. 对照组5例，取其正常的肠粘膜组织.

1.2方法

1.2.1匀浆制备每例CD患者取有病变肠粘膜活检组织(电子肠镜，富士EC-410型)，称重(上皿电子天平，JA2603型)、匀浆器匀浆，加生理盐水，使其终浓度为100g/L. 将100μL匀浆置于EP管中，按照DNA抽提试剂盒(上海华顺生物试剂公司)说明书进行操作，制备模板DNA利用副结核分枝杆菌IS900特异性引物(上海华顺生物试剂公司)进行扩增，序列为(5＇→3＇)：GTTCGGGGCCGTCGCTTAGG和GAGGTCGATCGCCCACGTGA，取样品10μL，加入200μmol/L的dNTP 3μL，25pmol/L的引物各2μL，Tap DNA聚合酶(华美生物工程公司)(5U)2μL，ddH20 24μL，10×buffer 5μL，上PCR热循环仪(P-E480型，Perkin Elmer公司). 扩增条件参照Sanderson et al^［4］的条件进行. 即95℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸3min. 阳性对照用副结核菌标准株(吉林省兽医科学研究所)，阴性对照为双蒸水. 电泳2h(电压为100MV)后，EB染色，紫外灯下观察. 质量控制：为了防止假阳性和假阴性，重新用IS900引物对CD匀浆扩增1次，条件同前. PCR的所有操作按Kwok et al^［5］提出质控标准进行.

1.2.2CD肠粘膜匀浆接种地鼠将制成的CD匀浆，于取材3h内接种地鼠(10～12周龄、♀健康的金黄地鼠50只，卫生部成都生物制品研究所提供). 每例CD匀浆接种5只地鼠，另取4只作对照(2只接种正常肠粘膜匀浆，2只接种生理盐水). 具体操作如下：地鼠腹腔注射3g/L戊苯巴比妥钠0.3mL，麻醉后，固定、剪毛、消毒、铺巾，取右下腹作一长约1.5cm的直切口，依次切开腹壁各层，在盲肠和未回的近系膜肠壁处，分别注射20μL匀浆，术后缝合腹壁各层，10d后拆缝线. 手术前后，每日观察大便性状、数量和有无血便. 4mo后断颈处死地鼠，作肉眼和组织学观察. 炎症程度评分按Tanaka et al^［6］的肠道损伤积分标准. 将有肉芽肿性改变的动物肠道组织，用IS900引物再次扩增，条件同前.

统计学处理肠道损伤积分采用t检验，肉芽肿性肠炎的发病率用χ²检验.

2结果

利用副结核杆菌IS900引物对5例CD匀浆进行扩增后，有2例扩增出400bp 的特异性DNA片段(图1)，另外3例为阴性. 重复扩增后，结果同前. CD肠粘膜匀浆接种地鼠4mo内，实验组有8只出现腹泻，未见血便，其中PCR阳性CD匀浆组5只，PCR阴性组3只. 而对照组仅有2只腹泻，未见血便. PCR阳性的CD匀浆接种地鼠后，有50%(5/10)地鼠的肠壁出现上皮样细胞聚集形成的肉芽肿性炎症(图2a,图2b)及溃疡形成，肠壁淋巴细胞浸润. PCR阴性的CD匀浆接种地鼠后，仅有6.7%(1/15) 只出现上皮样细胞聚集而成的肉芽肿性炎，两组动物肉芽肿性肠炎的发病率有显著性差异(P＜0.05). 而注射正常肠粘膜匀浆或生理盐水的对照组未见肉眼和组织学改变. PCR阳性组肠道损伤平均积分为4.8±2.4；PCR阴性组仅有1只出现肉芽肿性炎症，肠道损伤平均积分为3.7±1.7，两组无显著性差异(P＞0.05). CD匀浆组和正常肠粘膜组的肠道损伤平均积分分别为4.1±2.1和2.0±0.8，两组有显著性差异(P＜0.05). PCR阳性组CD匀浆接种动物后，5只出现肉芽肿性炎症，将含肉芽肿的动物肠组织再用副结核杆菌IS900引物扩增，均出现400bp 的DNA片段.

1 双蒸气(阴性对照)

2 CD匀浆

3 MP(阳性对照)

图1利用MP IS900引物扩增CD匀浆的结果

图2aPCR阳性的CD匀浆(含副结核杆菌)接种地鼠4mo后，出现回肠的全层炎症HE×53.3.

图2bPCR阳性的CD匀浆(含副结核杆菌)接种地鼠4mo后，出现回肠的全层炎症及肉芽肿形成HE×107.

3讨论

CD是一种病因未明的慢性肉芽肿性肠炎，症状主要有腹痛、腹泻、消瘦等，病理改变包括节段性肠壁发炎、增厚，肠系膜淋巴结肿大及非干酪样<