摘要

目的建立简便、快速的丙型肝炎病毒基因扩增产物的固相杂交检测方法.

方法将标记有生物素的寡核苷酸引物所扩增的丙肝病毒基因产物，与通过结合在微孔反应板上的特异性探针进行快速杂交，然后通过辣根过氧化物酶标记的抗生物素进行酶联显色，读取光密度值.

结果应用本方法对血清中丙型肝炎病毒核酸检测，灵敏度可达5拷贝～50拷贝/反应.

结论此方法简便、快速、特异性好、敏感性高、结果判定指标客观，可广泛应用于病毒感染的临床诊断和疗效评价及其他基因的扩增检测和基因分型等.

中国图书馆分类号R373.2

Solid phase hybridization detection of hCV RNA PCR products

WANG Feng-Shui¹, WANG Yu², lI Shi-Yong¹, AN Ping¹, YU Bo¹ and FENG bai-Fang²¹Department of General Surgery, Chinese pLA Beijing General Hospital, Beijing 100700, China²Institute of Hepatology, Beijing MedicalUniversity, Beijing 100044, China

Subject headingshepatitis c virus；RNA, viral/analysis; polymerase chain reaction; solid phase hybridization

Abstract

AIMTo establish a simple, rapid polymerase chain reaction (PCR) based DNA amplification technique for detecting HCV RNA PCR products.

mETHODSFor detecting HCV RNA, the primer labeled with biotin was used to amplify viral gene fragment. The 1st PCR product complemently hybridized with the specific probe covalently coupled onto microplate wells. Streptavidine-POD was used in colorimetric detection.

RESULTSThe sensitivity of the detection system is 5 copies-50 copies of hepatitis C genome respectively.

CONCLUSIONThe method is simple and rapid with high specificity, sensitivity and semiquantification. It can be generally applied in detection of foreign pathogen in blood, body fluid and tissue samples, in clinical diagnosis and evaluation of antiviral therapeutic effect.

0引言

丙型肝炎病毒(HCV)是输血后非甲非乙肝炎的主要病原体，为单链正股RNA病毒.我国是肝炎大国，对于持续性HCV感染所致疾病，人们希望找到一种诊断标志，可以较好地反映疾病的发展情况，预后分析以及进行治疗效果评价.随着基因分子生物学的发展和在病毒感染诊断方面的应用，最近人们越来越多地注意到，传统的PCR方法有一定的缺陷和不足，尤其是缺乏更高的特异性和客观性.并且注意到病毒持续性感染时，被感染者体内病毒的含量与临床发病情况、对治疗的反应性和预后评价密切相关.对于HCV感染者来说，被感染者血循环中HCV含量，是影响干扰素治疗效果的主要因素.病毒含量高者，治疗后病毒阴转率低，并在停药后病毒含量多回复到治疗前水平.最近又发现，在干扰素治疗初期，通过测定患者体内HCV水平是否降低，可有效地预测长期疗效.这些观察促进了人们对HCV含量水平检测手段的研究.由于很多人类致病病毒在人体内含量很低，直接进行核酸杂交，敏感性方面有很大局限，并且一般需要较昂贵的化学发光检测设备.我们建立了一种基于基因扩增技术，与结合在固相载体上的寡核苷酸进行分子杂交并用酶联显色作为指示的快速、简便的肝炎病毒核酸半定量方法和标准化检测方法.对病毒核酸特异性扩增产物进行定量分析，主要是基于扩增产物的量与被测样品中原始靶基因的含量有很好的对应关系，可以通过对扩增产物的含量分析，来反映被测病毒的实际含量^［1-5］.

1材料和方法

1.1材料固相杂交反应用96孔微孔反应板，购自丹麦Nuck公司. hCV固化探针为5 ＇-CTCATACTAACGCCATGGCTAGACGCTTTC-3 ＇，位于HCV基因5＇非编码区，为不同基因型中高保守序列.上述探针经过化学反应与微孔反应板形成共价键结合.简要过程如下：寡核苷酸探针以适当浓度在碳二亚胺的作用下，50℃孵育5h.用洗液洗板5次，每次2min，干燥，抽真空封存于铝箔袋中备用.血清CH950046为HCV持续性携带者血清，经套式PCR测定为10⁹拷贝/L^［6］.

1.2方法

1.2.1聚合酶链反应应用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取HCV rNA，空气干燥后溶于焦碳酸二乙脂(DEPC)处理的去离子水.

HCV基因逆转录-基因扩增操作如下：10μL逆转录反应体系中含提取的病毒核酸，100U逆转录酶(superscript gibco-BRL)及逆转录引物，5 ＇-TATCAGGCAGTACCACAAGG-3 ＇. 于42℃反应60min，合成cDNA.基因扩增反应使用生物素标记的正链引物5 ＇-CTGTGAGGAACTACTGTCTT-3＇，扩增产物为254bp. 反应循环为94℃ 30s；55℃ 30s；72℃ 45s，共进行35个循环，取10μL扩增产物进行20g/L琼脂糖凝胶电泳观察.套式PCR反应时，取5μL一次PCR产物，用一对内引物进行扩增，特异性扩增产物为145bp.

1.2.2固相杂交取扩增产物10μL，于94℃热变性10min后置冰浴2min，加至结合有特异性寡核苷酸探针的微孔反应板中，并加杂交液(含500g/L甲酰胺，6×SSC，1×FPG，25mmol/L kH₂PO₄，2g/LSDS，及200mg/L鱼精DNA)至100μL，充分混匀后于37℃杂交60min.用37℃预热的洗液洗板4次，每次2min.

1.2.3酶结合显色杂交后，反应孔用10g/L小牛血清清蛋白于37℃封闭10min，弃去封闭液，加入100μL辣根过氧化物酶标记的链霉抗生物素2mg/L(Vector,SA-5004，美国)于37℃育30min，用洗液洗板4次，每次2min.以邻苯二胺显色15min，加100μL 1mol/L硫酸终止反应，测A_492nm值.

2结果

2.1定量检测条件的确定HCV基因5＇非编码区寡核苷酸探针溶于0.1×TE，按(500～0.08)ng，100μL/孔，不同浓度包被微孔反应板，取10μL基因扩增产物进行固相杂交，酶反应显色，读取光密度值A_492nm.寡核苷酸探针用量与A_492nm的对应关系见图1.当每个反应孔所用探针量大于200ng时，A_492nm值已大大超过光密度计测定线性范围，并趋饱和，本研究中选200ng/孔作为优选工作浓度.为确定酶联显色时所用过氧化物酶浓度，取2μL PCR产物进行快速杂交，以(5-0.5)mg/L不同浓度的酶进行显色反应(图2).根据阴性、阳性对照标本A_492nm值的比较. 选取2mg/L酶浓度作为常规工作浓度.

图1寡核苷酸探针包被量与A_492nm的对应关系

图2不同酶浓度与A_492nm的对应关系

2.2逆转录-基因扩增产物的含量分析应用生物素标记的引物扩增所得产物进行直接分析，检出的扩增产物最低DNA量为2pg.富含丙肝病毒的血清用TE缓冲液进行10倍系列稀释，每一稀释度样品取3管分别提取病毒核酸进行逆转录和套式基因扩增反应. a，B，C为3次扩增实验，第1次PCR反应产物在10^-2～10^-3稀释度时可见弱阳性条带(图3)，对此系列产物进行固相杂交显色测定，结果见表1及图4(A).根据50例HCV RNA阴性标本所得光密度平均值为0.034，标准差为0.015，Cut off值取均值加3倍标准差，为0.079. 对3次反应结果进行平均计数，此血清中所含丙肝病毒阳性反应的最高稀释度为10^-4，即可测出5个病毒基因拷贝，套式PCR产物电泳结果，3次反应的阳性最高稀释度均为10^-5，即可检出1个拷贝(图3).比较起来，固相杂交-酶显色测定方法比套式PCR方法的检出敏感性低一个数量级.应用固相杂交检测2次PCR产物，其灵敏度与电泳检测相同［图4(B)］.

图3HCV逆转录-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳.同一血清10倍系列稀释，3次重复试验一. 1-7：血清10倍系列稀释，从10⁰至10^-6稀释.

m：核酸分子质量标准. N：阴性对照.

图4应用固相杂交酶促显色半定量检测结